鸡破骨细胞分化因子(chRANKL)的克隆、表达和活性分析

摘要

以鸡(Gallus domesticus)成骨细胞总RNA为模板,利用RT-PCR和SOE-PCR技术体外扩增鸡破骨细胞分化因子(RANKL)基因,将PCR产物克隆至组氨酸标签的融合蛋白表达载体pET-32a(+),在异丙基-?D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下,实现了chRANKL的有效表达,表达产物纯化后稀释成不同浓度梯度作用成熟破骨细胞观察其生物学活性.结果表明,凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为1 200 bp左右,插入片段与GenBank上报道的鸡RANKL序列完全一致.重组表达载体转化BL21后经IPTG诱导获得大小约为64 kD的重组蛋白,Western印迹表明重组蛋白能与抗组氨酸抗体相结合,具有特异反应性;并且纯化后的蛋白能刺激成熟破骨细胞,使骨吸收指数呈剂量依赖性增加,表明具有一定的活性.