鸡核因子-κB受体激活物配基(chRANKL)基因的克隆、表达及生物学活性研究

摘要

核因子-кB受体激活物配基RANKL(receptor activator of NF-кB ligand，RANKL)最早发现于哺乳动物，属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的一员，它参与破骨细胞形成的全过程：分化、融合、生存、激活，被认为是介导各种刺激因子诱导破骨细胞生成及功能信号传导的最终因子。鉴于RANKL在骨代谢中的重要调节作用，本文旨在克隆表达蛋鸡RANKL蛋白，并对其生物学活性进行研究，为进一步研究笼养蛋鸡骨质疏松发生机制提供新的思路。 试验I、chRANKL编码区基因的克隆与序列分析 应用RT-PCR方法从体外培养鸡胚成骨细胞中扩增得到鸡RANKL编码基因(Genbank登录号EF379383)，然后将特异性片段连接到pMD18-T载体，经酶切、PCR鉴定及DNA序列测定。结果表明，扩增得到1203 bp的RANKL序列，扩增序列与GenBank上报道的预测序列具有很高的相似性，达到99.3％，与人、小鼠、犬的一致性分别为55.4％、52％和55.7％，进化树分析结果表明RANKL作为机体内调节骨代谢一种重要细胞因子，在进化中高度保守。RANKL基因的成功扩增为深入研究骨质疏松等代谢性骨病的发病机制及防治开辟广阔的领域。 试验II、chRANKL的原核表达和纯化 设计一对引物用于克隆鸡RANKL成熟蛋白编码基因，然后构建鸡RANKL原核表达载体pET-32a(+)-chRANKL，通过IPTG诱导表达重组鸡RANKL成熟蛋白，经SDS-PAGE电泳分析，原核表达产物为64 kD的重组蛋白，并主要以包涵体形式存在，western blot分析结果显示，表达得到的重组蛋白具有良好的抗原结合活性。 试验III、chRANKL诱导鸡骨髓细胞形成破骨样细胞的研究 建立简便有效的鸡胚骨髓破骨样细胞的诱导培养体系，获得高密度高纯度的破骨细胞，为进一步研究笼养蛋鸡骨质疏松症的发病机理奠定基础。剔取18日龄鸡胚胫骨和肱骨，用注射器抽取a-MEM培养液冲洗骨髓腔，获取的细胞悬液接种于培养板。2h后吸取未贴壁细胞，离心重悬，使细胞密度为2×106/mL，接种于培养板，加入诱导剂RANKL和M-CSF，成功获得具有破骨细胞特征的细胞：细胞大，多核；TRAP染色阳性，在骨片表面形成吸收陷窝；这表明chRANKL能诱导鸡破骨细胞前体细胞形成OLC，说明chRANKL在鸡OC分化、成熟过程中起重要作用。但加入chOPG后，则大大降低了OLC的形成以及OLC的骨吸收作用，表明chOPG阻断了RANKL介导的OC分化和骨吸收作用。 试验IV、chRANKL在毕赤酵母中的表达和生物学活性研究 设计另一对引物用于克隆鸡RANKL成熟蛋白编码基因，然后构建鸡RANKL真核表达载体pPICZa-A-chRANKL，以电穿孔法转化酵母X-33，用Zeocin平板筛选重组子，经甲醇诱导表达后，SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物，表达产物相对分子量为54 kDa，表达量约为220 mg/L，经Western印迹验证，表达得到的蛋白能够与抗人RANKL IgG反应，表明通过酵母表达得到的蛋白具有较好的免疫原性。 试验V、chRANKL酵母冻干产物体内、体外对成熟破骨细胞的影响 50羽青年ISA蛋鸡分为5组，A组为对照组，只注射生理盐水，B、C、D、E组分别注射剂量为0.01 mg/kg，0.05 mg/kg，0.1 mg/kg，0.5 mg/kg的RANKL酵母表达冻干产物水溶物。2h后静脉采血，测定血浆钙离子浓度。同时将浓度为2 ng/mL，6ng/mL，10 ng/mL分别加入体外培养的成熟被骨细胞中，培养第3d观察骨吸收陷窝的变化，并测定培养液中钙离子浓度。结果表明，体内注射RANKL后，血浆钙离子浓度升高，且呈剂量依赖性增加。不同浓度的RANKL加入到体外培养的成熟破骨细胞能使骨吸收指数和骨吸收陷窝面积均呈剂量依赖性增加，同时钙离子浓度也有显著差异。结论：RANKL除了能诱导形成破骨样细胞外，也能刺激成熟破骨细胞，使之骨吸收功能增强。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明：缩略语

声明

上篇文献综述：第一章 RANKL的研究进展

1 RANKL的发现

2 RANKL的结构和分布

3 RANKL的信号转导通路

4 RANKL分子功能

5 RANKL与骨免疫学

6 RANKL与一些骨疾病的关系

参考文献

上篇文献综述：第二章破骨细胞的研究进展

1破骨细胞的来源分化及其骨吸收机制

2破骨细胞分化的信号传导途径

3 OC、OB的相互调节

4破骨细胞与骨吸收

5获得OC方法的研究现状

6破骨细胞与骨破坏疾病的治疗策略

参考文献

下篇试验研究：第三章鸡NF-κB受体激活物配基（chRANKEL）编码区基因的克隆与序列分析

摘要

引言

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

下篇试验研究：第四章chRANKL的原核表达和纯化

摘要

引言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

下篇试验研究：第五章chRANKL诱导鸡骨髓细胞形成破骨样细胞的研究

摘要

引言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

下篇试验研究：第六章 chRANKL在毕赤酵母中的表达及生物学活性研究

摘要

引言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

下篇试验研究：第七章鸡RANKL酵母冻干产物体内、体外对成熟破骨细胞的影响

摘要

引言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

5课题展望

参考文献

全文总结

本文创新之处

附 录

致 谢

攻读博士学位期间发表论文