梁平柚鼠李糖基转移酶基因(Cm1,2RhaT)的克隆与表达分析

摘要

柚皮苷是一种双氢黄酮类化合物的苦味剂,鼠李糖基转移酶是柚皮苷的合成过程中的关键酶.本研究通过RT-PCR方法从梁平柚(Citru maxima cv.Liangping)扩增到鼠李糖基转移酶(Cm1,2RhaT)基因,构建了该基因的原核表达载体pET28a-CmRhaT并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)中,诱导表达并分离纯化得到融合蛋白.利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测Cm1,2RhaT基因在梁平柚等5个柑橘品种叶片、果实及不同发育时期的表达差异.研究结果获得Cm1,2RhaT的DNA和cDNA序列(GenBank登录号:JQ217381),cDNA长1 436 bp,推测的编码蛋白Cm1,2RhaT包含453个氨基酸,理论分子量为51.2 kD.分离纯化得到了较高浓度(0.526 mg/mL)和纯度(95％)的融合蛋白.定量分析表明,该基因在梁平柚的果实和叶片中均有表达.从开花后30～180 d,该基因的表达量总体上随着果实的成熟而逐渐降低.其同源基因在其它品种中也呈现和梁平柚基本一致的波动性表达模式.本研究从梁平柚中扩增出一个Cm1,2RhaT基因,其表达的酶具有典型的糖基转移基团,是柑橘苦味物质之一黄烷酮合成中的关键酶,参与柑橘次生代谢过程,可能是无苦味柑橘品种改良的一个切入点.