梁平柚鼠李糖基转移酶基因Cm1,2RhaT的克隆及表达分析

摘要

柚Citrusgrandis(L.)Osbeck又名抛、文旦等,是芸香科(Rutaceae)柑桔属(Citrus)植物。已证实柑橘苦味来自两方面的作用,黄酮类化合物中的柚皮苷和柠檬苦素类化合物。柚皮苷、柠檬苦素在柚果实中均有较高的含量[1],柚皮苷是柚中主要的黄烷酮,具有降低血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(动脉粥样硬化的主要致病因素)水平的作用[2]。在食品工业上,柚皮苷既可作为天然色素、风味改良剂和苦味剂用于食品、饮料的生产,又可作为合成高甜度、无毒、低能量的新型甜味剂二氢柚苷查尔酮和新橙皮苷查尔酮的原料[3]。柚皮苷的应用将越来越广泛。在植物次生代谢物合成途径中关键酶的分离及其基因的克隆是植物次生代谢酶促反应机制研究的基础,而特定植物次生代谢物合成与积累量取决于其合成途径中的限速酶,它们在植物次生代谢物生物合成途径中往往位于代谢支路分叉口或途径的下游[4]。鼠李糖基转移酶作为柑橘中最主要的苦味物质柚皮苷合成过程中的关键酶近年来受到广泛的关注。
　　 本研究在前人研究的基础上,从梁平柚中扩增出了一个鼠李糖基转移酶基因Cm1,2RhaT。构建了Cm1,2RhaT基因的原核表达载体,研究的主要结果如下:
　　 1.鼠李糖基转移酶基因Cm1,2RhaT的扩增及编码蛋白性质分析
　　 根据GenBank公布的鼠李糖基转移酶(RhaT)基因的cDNA序列,设计并合成特异性引物。以梁平柚成年树幼叶为材料,通过PCR和RT-PCR方法扩增到鼠李糖基转移酶(RhaT)基因Cm1,2RhaT的DNA序列和cDNA序列(GenBank登录号为:JQ217381)。cDNA长1436bp,推测的编码蛋白Cm1,2RhaT包含453个氨基酸,理论分子量为51.2kd。进一步分析可知其有14个磷酸化位点,没有信号肽。Cm1,2RhaT蛋白二级结构由α螺旋(helix,42.04%),延伸链(extendedstrand,16.15%),随机卷曲(randomcoil,41.81%)组成。在NCBI上对其保守结构域分析发现Cm1,2RhaT基因编码的蛋白质属于Glycosyltransferase_GTB_type超家族。
　　 2.Cm1,2RhaT基因原核表达载体的构建及表达体系的优化
　　 将Cm1,2Rha瑾因克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmRhaT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经最优条件(4h,37℃和1.0mmol·L-1IPTG)诱导表达获得大小约为56kD的目的融合蛋白,对融合蛋白进行可溶性分析发现该融合蛋白以包涵体形式存在。
　　 3.Cm1,2RhaT蛋白质的分离纯化、复性与活性检测
　　 重组蛋白以包涵体的形式存在,以6M的尿素溶解包涵体,按Merck公司的蛋白纯化系统操作指南进行分离纯化并稍做改进,通过透析复性,分离纯化得到了较高浓度0.526mg.ml-1和纯度为95%的融合蛋白。利用柚果皮和叶片中的天然物质测定酶活性,得到的数据不能够计算出酶活力,但能看出叶片中的柚皮苷含量比果实中的高。
　　 4.Cm1,2RhaT基因表达分析
　　 利用SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测梁平柚的Cm1,2RhaT基因以及其它4种柑橘品种温州蜜柑(Citusreticulatecv.Unshiu),、费米耐劳(CitruslimonL.BumF.Femminello)、沙田柚(Citusmaximacv.Shatian)、血橙(Citrussinensiscv.(L.)Xuecheng)的同源基因在不同时期的表达。定量分析表明该基因在梁平柚叶片的表达量显著比高于果实。从开花后30天到180天,该基因的表达量总体上随着果实的成熟而逐渐降低。其同源基因在其它品种中也呈波动性表达模式。5个品种都有表达且表达趋势基本一致。