稳定表达猪SARM1的MARC-145细胞系的建立

摘要

猪(Sus scrofa)SARM1基因是重要的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)候选基因,建立稳定表达SARM1的猴胚胎肾上皮细胞系(MARC-145)是进行SARM1功能研究的基础.本研究成功构建pEGFP-N1-pSARM1真核表达载体,并在MARC-145细胞中瞬时转染,结果显示,猪SARM1-GFP融合蛋白定位于MARC-145细胞的线粒体.使用浓度为800 μg/mL的G418对转染pEGFP-N1-pSARM1的细胞进行加压筛选6d,并进一步使用单克隆法筛选出稳转细胞系,结果显示,稳转细胞系形态正常,绿色荧光稳定表达.RT-PCR和Western blot检测结果均显不SARM1基因在稳转细胞系中稳定表达.应用qRT-PCR方法在PRRSV感稳转细胞系12h后可以检测到PRRSV开放阅读框7(open reading frame 7,ORF7)在稳转细胞系中表达,并且稳转细胞系中ORF7的表达量在感染后12、24和48 h极显著低于普通MARC-145细胞中的表达量(P＜0.01).组织半数感染量(50％ tissue culture infective dose,TCID50)测定进一步证明PRRSV在稳转细胞系中复制能力较低.本研究为进一步开展猪SARM1在PRRSV感染过程中的功能研究提供了基本材料.