稳定高效表达猪CD163的MARC-145细胞系的构建与鉴定

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，该病以妊娠母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状为主要特征，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染，给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失。现阶段使用疫苗免疫仍是防治PRRS流行的主要手段。
　　病毒的体外分离和鉴定是研究和防治PRRS的基础和前提，而PRRSV表现出相当严格的细胞嗜性，在体外培养时仅能感染猪肺泡巨噬细胞、猪脾巨噬细胞和源于MA-104的几个亚细胞系(MARC-145、CL2621、HS.2H)。由于最容易感染PRRSV的巨噬细胞难于获得且只能原代培养，操作成本高昂，而且目前常用的MARC-145细胞虽然可以增殖PRRSV，但是存在着PRRSV增殖速度慢、滴度低的局限性，因此建立一种能够快速、高效地增殖PRRSV的细胞系成为当务之急。
　　PRRS侵染宿主细胞的第一步是与细胞上的受体结合，研究表明CD163作为PRRSV的受体介导病毒的脱衣壳和病毒核酸在细胞质内的释放，与PRRSV的感染密切相关，并且Patton等人的研究结果表明PRRSV的感染能力与CD163受体的表达水平具有直接的相关性。因此，本研究旨在构建一株能够稳定、高效表达CD163的MARC-145细胞系，从而能够高效、快速地增殖PRRSV，为PRRSV的相关研究和疫苗开发奠定基础。
　　本研究根据GenBank中收录的相关序列设计引物从PAM（猪肺泡巨噬细胞）中扩增pCD163基因，将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163，将该重组质粒转染MARC-145细胞，通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达猪CD163的MARC-145细胞系，命名为pCD163-MARC。间接免疫荧光(IFA)结果显示，构建的pCD163-MARC细胞系中荧光强度明显高于普通MARC-145细胞;Western blot结果显示pCD163-MARC细胞系中pCD163蛋白表达量约为对照MARC-145细胞中pCD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代，各代次之间pCD163蛋白表达量无明显差异。将pCD163-MARC细胞与MARC-145细胞同时感染1MOI的PRRSV经典株SD-1株和高致病性毒株SD-JN株，测定pCD163-MARC和MARC-145细胞增殖PRRSV的生长曲线实验表明pCD163-MARC细胞增殖两株病毒的滴度有了明显提高。RT-PCR实验亦表明pCD163-MARC细胞增殖的PRRSV的RNA量明显高于MARC-145细胞。
　　在该细胞系的应用方面，我们将本实验室2012.06-2014.06期间RT-PCR检测阳性的PRRSV病料样品120份同时接种pCD163-MARC细胞与MARC-145细胞，盲传5代后两者对PRRSV的分离率分别为100％和80％，pCD163-MARC细胞显然具有更高的PRRSV分离率，更适合于临床PRRSV的分离培养。我们将pCD163-MARC细胞与MARC-145细胞扩大至转瓶培养，同时感染1MOI的广东大华农动物保健品股份有限公司生产的PRRS疫苗JXA1-R株，96 h收毒，结果显示病毒在pCD163-MARC细胞上的滴度为1×108.5TCID50/mL，在MARC-145细胞上的滴度为1×107.6TCID50/mL。说明pCD163-MARC细胞比MARC-145细胞具有更强的增殖PRRS疫苗JXA1-R株的能力，可以初步应用于PRRS疫苗毒的生产。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1.1 PRRSV病原学特性

1.1.1 PRRSV的生物学特性

1.1.2 PRRSV基因组结构

1.1.3 PRRSV基因组编码的蛋白

1.1.4 PRRSV的致病机制

1.2 PRRSV引起宿主的免疫应答

1.2.1 先天性免疫

1.2.2 获得性免疫

1.3 PRRSV细胞受体研究进展

1.3.1 病毒受体的概述

1.3.2 病毒侵入宿主细胞的过程

1.3.3 细胞上的PRRSV受体

1.3.4 构建表达CD163蛋白的细胞系研究进展

1.4 PRRS疫苗研究进展

1.4.1 灭活疫苗

1.4.2 弱毒疫苗

1.4.3 基因工程疫苗

1.5 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 细胞、毒株及载体

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 PAM细胞的分离培养及总RNA的提取

2.2.2 pCD163基因的克隆

2.2.3 真核表达载体pCI-pCD163的构建

2.2.4 MARC-145细胞G418耐受性测试

2.2.5 稳定高效表达pCD163的MARC-145细胞系的构建

2.2.6 pCD163-MARC细胞系的鉴定

2.2.7 pCD163-MARC细胞系增殖PRRSV能力的测定

2.2.8 pCD163-MARC细胞系的应用

3 结果与分析

3.1 pCD163基因的克隆

3.2真核表达载体pCI-pCD163的构建及鉴定

3.3 稳定表达猪CD163蛋白的MARC-145细胞系的构建及鉴定

3.3.1 pCD163-MARC细胞系的构建

3.3.2 IFA检测pCD163-MARC细胞系中CD163的表达情况

3.3.3 Western blot检测pCD163-MARC细胞系中CD163表达情况

3.4 pCD163-MARC细胞系增殖PRRSV能力的测定

3.4.1 pCD163-MARC和MARC-145细胞增殖PRRSV的生长曲线测定

3.4.2 pCD163-MARC和MARC-145细胞螬殖PRRSV的RNA测定

3.5 pCD163-MARC细胞系的应用

3.5.1 临床样品PRRSV的分离

3.5.2 PRRS疫苗毒的初步生产

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

硕士期间论文发表情况