核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因克隆及诱饵蛋白表达载体构建

摘要

真菌多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)能够特异性识别真菌分泌的降解植物细胞壁的主要物质多聚半乳糖醛酸酶(PG)并抑制其活性.目前,酵母双杂交技术是快速、有效获取植物PGIP的主要途径,而其前提是要获得真菌PG的酵母诱饵载体.本研究以核盘菌的PG cDNA为模板,经PCR扩增获得1 125 bp片断,进一步将其克隆到pEASY-T1载体上.以克隆了目的基因的pEASY-T1质粒为模板,用含NdeⅠ和SalⅠ位点的引物对PG-F2/PG-R2扩增获得1 125 bp大小的目的片段,将其连接到pEASY-T1上生成pEASY-PG.用NdeⅠ和SalⅠ双酶切pEASY-PG,回收1 125 bp片段并连接到诱饵载体pGBKT7相应的酶切位点上,转化大肠杆菌菌株DH5α.在含有卡那青霉素的LB平板上筛选获得重组质粒.经NdeⅠ和SalⅠ双酶切后获得预期的1 125 bp DNA片段,表明诱饵蛋白载体pGBKT7-PG6构建成功.应用醋酸锂介导法将pGBKT7-PG6转化酵母菌株Y187,经激活培养基上培养检测,未发现蓝色菌落,表明酵母转化子自身不具有自激活功能,可用于大规模筛选经核盘菌诱导的cDNA表达文库.