碱性土壤微生物基因的克隆和多样性分析

摘要

从碱性土壤样品中直接抽提和分离宏基因组DNA, 首先构建了包含5 562个阳性克隆的碱性土壤16S rDNA文库, 随机抽取9个克隆测序后构建的系统进化树表明了碱性土壤环境微生物种群基因的多样性.纯化土壤宏基因组DNA后采用EcoRⅠ酶部分酶切处理, 我们又构建了以pGEM-3Zf(+)为载体的DNA部分文库AL01.AL01文库包含23650个克隆, 随机插入载体的外源DNA片段平均大小为3.2 kb左右, DNA文库的总容量为75.68 Mb.建库效率为从每克环境样品中获得6 000个左右的含随机外源DNA片段插入载体的克隆.采用酶活筛选策略, 我们从AL01文库中筛选到一个编号为pGXAA2011的阳性克隆携带有一个完整的碱性蛋白酶基因.蛋白酶活性检测其酶活作用最佳温度为40℃, 最适作用pH 值为9.5.另外, 我们还克隆和表达了一个新型β-葡萄糖苷酶基因unglu01, 该基因和现有数据库中的β-葡萄糖苷酶基因没有任何DNA或者氨基酸水平的同源性.将unglu01基因的ORF与表达载体pETBlue-2连接后导入宿主菌株Tuner(DE3)pLacI中, 该重组表达克隆在含柠檬酸高铁铵和七叶苷的LA平板上表现清晰的β-葡萄糖苷酶活性, SDS-PAGE电泳可以检测到29 kDa大小的目的蛋白.