携带FAT1-FAT2基因打靶载体构建及其在猪肾细胞的表达与功能鉴定

摘要

[目的]ω-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)对人类具有重要的营养价值与医疗作用.随着生物技术的发展,通过转基因技术可实现哺乳动物体内自身合成多不饱和脂肪酸,进而改变猪肉中不饱和脂肪酸的含量和种类,对人类的营养健康具有积极意义.[方法]克隆猪体内缺乏的ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因FAT1和Δ-12脂肪酸去饱和酶的关键基因FAT2,构建携带FAT1-FAT2双基因的多位点打靶载体.该载体以猪rRNA基因间的内部转录间隔序列为靶位点;为提高定点整合效率,引入NEO、TK正负筛选系统进行双重选择;加入EGFP报告基因和Cre/Loxp系统,便于筛选阳性同源重组细胞克隆及后期删除筛选基因.将所构建的携带FAT1-FAT2双基因的打靶载体,通过脂质体介导瞬时转染猪肾细胞PK15.[结果]RT-PCR结果显示,FAT1-FAT2双基因在猪肾细胞PK15中实现表达;脂肪酸测定结果显示,ω-6 PUFAs、ω-3PUFAs在对照组PN1(转染对照质粒PN1)、转染试验组PF1(转染携带FAT1基因)、转染试验组PF1F2(转染携带FAT1-FAT2双基因)中的含量分别为7.9％、7.03％、3.92％和5.64％、7.01％、9.43％,差异均显著;ω-6/ω-3比例由对照组的1.4显著下降到试验组的0.42～1.[结论]构建携带FAT1-FAT2双基因的打靶载体转染猪肾细胞PK15可以表达产生FAT1-FAT2 mRNA,且可以显著提高转染细胞中ω-3 PUFAs的含量,为下一步生产转FAT1-FAT2双基因猪奠定基础.