鲈鱼脯氨酰内肽酶的分离纯化、性质分析及分子克隆

摘要

采用(NH4)2SO4盐析和连续柱层析法从鲈鱼(Lateolabrax japonicus)骨骼肌中分离纯化了一种脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP).通过液相色谱-串联质谱分析,得到43个与红鳍东方纯的PEP高度一致的肽片段,证实该酶为PEP.以琥珀酰-甘氨酰-脯氨酸-4-甲基-7-香豆素为底物,确定PEP的最适pH 6.0和最适温度35°C.温度变化对PEP活力的影响较大,通过圆二色谱检测显示加热对PEP的二级结构有较为明显的影响,且热变性不可逆.通过分子克隆技术获得PEP全长cDNA开放阅读框含2226个核苷酸,编码741个氨基酸残基,预测分子质量为84.12 kDa.通过同源建模得到鲈鱼PEP的分子结构,PEP为典型的α/β水解酶折叠排列,其催化三联体(His-711、Asp-672、Ser-585)被β-折叠形成的螺旋桨区域的中心通道所覆盖.催化活性中心空间构象稳定对维持PEP活力至关重要,而其独特的分子结构是底物特异性的基础.