皱纹盘鲍脯氨酰内肽酶的分子克隆、体外表达及相关性质分析

摘要

脯氨酰内肽酶(Prolyl endopeptidase/PEP/PREP)隶属于丝氨酸蛋白酶家族，在医学，食品科学中有较大应用潜力。本研究选用皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)，克隆得到皱纹盘鲍脯氨酰内肽酶的cDNA序列并进行体外表达，同时对其性质进行了相关研究。
　　通过对多个物种的PEP基因中的保守序列进行分析后设计特异性引物，采用巢式PCR和RACE技术从皱纹盘鲍的肝胰腺组织中克隆获得了脯氨酰内肽酶(Hdh-PEP)基因的cDNA全长序列。序列分析结果显示Hdh-PEP的cDNA全长共3224个碱基对(bp)，包含5'端非编码区序列51bp，3'端非编码区1052bp，开放阅读框2121bp，编码706个氨基酸残基。序列比对结果显示，Hdh-PEP的氨基酸序列与太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、和人(Homo sapiens)PEP的序列相似度分别为70％、65％和63％。经预测，Hdh-PEP基因编码的蛋白相对分子质量为80.3ku，理论等电点为5.55，属于相对稳定的亲水蛋白。Hdh-PEP的二级结构与三级结构模拟分析显示其具有典型的PEP家族特征，有“α-催化结构域”和“β-螺旋桨结构域”两部分形成的“匣式”结构。系统发育关系分析结果表明Hdh-PEP在腹足纲PEP中形成了独立的进化分支。
　　通过将编码Hdh-PEP的全长序列连接至pET-28a载体上，构建了原核重组表达载体pET-28a-HP。表达并纯化了具有酶活性的重组Hdh-PEP。重组Hdh-PEP的理论相对分子量为85.4ku，包含了原Hdh-PEP80.3ku以及载体自带的组氨酸标签等序列4.1ku，与SDS-PAGE结果相符。对纯化产物进行肽质量指纹质谱分析获得结果与分子克隆结果相比较，氨基酸序列100％相符，证明重组表达得到的蛋白为Hdh-PEP。
　　酶学性质分析表明，Hdh-PEP的最适温度和最适pH分别为20℃和6.0，且在低温范围内(10℃-20℃)和pH6.0-9.0时能保持相对较高的酶活力，在温度高于30℃时即失活。Hdh-PEP能够特异分解羧基端含有脯氨酸残基的荧光底物Suc-Gly-Pro-MCA和Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MCA，在最适环境下进行分解时的比活力为6.57U/μg。
　　选取了多种抑制剂及金属离子对Hdh-PEP进行了抑制作用分析，结果显示，特异性抑制剂SUAM-14746能够强烈抑制Hdh-PEP的活性，Na+和Mg2-对Hdh-PEP的活性没有产生显著影响。Ca2+对Hdh-PEP的活性可起到少许促进作用。合成小肽EGAR和水飞蓟宾(Silibinin)对Hdh-PEP的抑制效果相对较弱。SUAM-14746对Hdh-PEP表现为竞争性抑制作用，Cu2+对Hdh-PEP的抑制类型为混合型抑制。Zn2+和Al3+在抑制Hdh-PEP活性时会对其二级结构产生影响，而Cu2+，Pb2+和Ag+抑制Hdh-PEP活性时不会对其二级结构产生明显影响。
　　使用Western Blot技术检测Hdh-PEP在皱纹盘鲍各组织中的表达量。结果显示，实验所用的兔抗罗非鱼PEP多克隆抗体对天然Hdh-PEP和重组Hdh-PEP均有特异性的免疫杂交反应。Hdh-PEP在皱纹盘鲍血细胞中的表达量较高，鳃中次之。但未能在腹足肌肉中检测到Hdh-PEP的表达。
　　通过对Sigma-Aldrich公司产品化PEP储存液配方进行改良，改良后的储存缓冲液可在75天内将Hdh-PEP的活性保持在90％以上。本研究对皱纹盘鲍PEP的分子克隆丰富了贝类PEP的研究内容并建立了稳定的表达体系。为贝类PEP的后续研究提供了一定的理论基础。

目录

声明

摘要

主要符号表

1．1 皱纹盘鲍

1．2 脯氨酰内肽酶

1．3 选题依据

第2章 实验材料与方法

2．1 实验用试剂

2．2 实验用仪器

2．3 实验用溶液及其配制方法

2．4 实验方法

2．4．1 皱纹盘鲍脯氨酰内肽酶的基因克隆

2．4．2 皱纹盘鲍PEP(Hdh-PEP)的体外表达

2．4．3 Hdh-PEP的相关性质分析

第3章 实验结果与分析

3．2 Hdh-PEP的生物信息学分析

3．2．1 Hdh-PEP的序列分析

3．2．2 Hdh-PEP的理化参数

3．2．3 Hdh-PEP的高级结构预测

3．2．4 Hdh-PEP的序列相似性分析

3．3 Hdh-PEP的重组表达与分离纯化

3．3．2 Hdh-PEP的体外诱导表达

3．3．3 表达产物的肽质量指纹图谱分析

3．4 Hdh-PEP的酶学性质分析

3．4．1 Hdh-PEP的最适反应条件分析

3．4．2 Hdh-PEP的底物特异性研究

3．4．3 Hdh-PEP的酶活力单位标定

3．4．4 Hdh-PEP的低温性质机理探究

3．5 Hdh-PEP的抑制剂相关研究

3．5．1 金属离子及其他物质对PEP的抑制作用研究

3．5．2 SUAM-14746和Cu2十对Hdh-PEP的抑制机理研究

3．5．3 Hdh-PEP的圆二色谱相关分析

3．6 Hdh-PEP的Western Blot实验

3．7 Hdh-PEP的储存方案探究

第4章 讨论

4．2 Hdh-PEP的体外表达与纯化

4．3 Hdh-PEP的基础酶学性质研究

4．4 Hdh-PEP的抑制剂相关研究

4．5 金属离子存在下Hdh-PEP的圆二色谱分析

4．6 Hdh-PEP的Western Blot分析

4．7 Hdh-PEP的存储方案探究

5．1 结论

5．2 创新点

5．3 展望

致谢

参考文献

在学期间科研成果