γ-谷氨酰转肽酶高效表达及其催化合成γ-谷氨酰苯丙氨酸

摘要

γ-谷氨酰转肽酶( γ-glutamyltranspeptidase,GGT)可催化苦味氨基酸形成氨基酸衍生物,从而降低食物的苦味,在食品行业具有很好的应用前景.为了提高 GGT 表达量,基于 NH +4 ,邻苯二甲醛( O-phthalaldehyde, OPA),三氯乙酸( trichloroacetic acid,TCA)与二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide,DMSO)之间的显色反应,建立一种用于获得 GGT高表达量菌株的高通量筛选方法.易错 PCR 对 HpaII-10 区上游的7 个碱基进行随机突变,筛选得到 EF3HpaII突变体,使 GGT表达量较原始启动子提高了 63% .建立核糖体结合位点( ribosome binding site, RBS)文库,筛选得到 RBS362,与 EF3HpaII共同调控ggt表达,可使重组菌GGT表达量提高至60. 25 U/mL,是原始菌的2. 02 倍. GGT催化 L-苯丙氨酸(L-phenylalanine,L-Phe)合成 γ-谷氨酰苯丙氨酸(γ-glutamylphenylalanine, γ-Glu-Phe) ,在最优条件下:底物浓度为50 mmol/L L-谷氨酰胺( L-glutamine,L-Gln)和200 mmol/L L-Phe,酶浓度为1 U/mL,初始反应温度35 °C,pH 10. 0,γ-Glu-Phe最终产率高达94% .