腺病毒介导siRNA抑制人胃腺癌细胞VEGF表达

摘要

目的:构建重组腺病毒Ad-siRNA-VEGF并观察其抑制人胃腺癌细胞(MGC-803)血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表达的效果。方法:①选择针对人VEGFmRNA的特异性siRNA靶序列,设计、合成其相应的双链DNA,插入pSUPER质粒,得到psiRNA-VEGF;NotⅠ和XhoⅠ双酶切psiRNA-VEGF得siRNA-VEGF表达片段;插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack,构建pAdTrack-siR-NA-VEGF,后者与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组后,酶切鉴定、293细胞包装、扩增,得到重组腺病毒Ad-siRNA-VEGF;②Ad-siRNA-VEGF转染MGC-803细胞96h后,RealTimePCR检测细胞VEGFmRNA水平、ELISA测定细胞培养液上清VEGF蛋白浓度。结果:成功构建重组腺病毒Ad-siRNA-VEGF,293细胞包装1d后观察到绿色荧光蛋白表达,氯化铯梯度离心纯化获得约3.6×108efu/ml滴度的重组腺病毒;Ad-siRNA-VEGF转染MGC-803细胞96h后,其VEGFmRNA水平下降了67.1%,培养液上清VEGF蛋白浓度下降了72.5%(P<0.01)。结论:腺病毒介导的RNAi技术可显著抑制人胃腺癌细胞的VEGF表达,这为抗血管生成治疗肿瘤的进一步研究开辟了新的方向。