胞浆转导肽介导抑癌基因NPRL2对肾癌细胞凋亡及Bax-Caspase3凋亡通路的影响

摘要

目的:证实胞浆转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)介导抑癌基因NPRL2以CTP-NPRL2融合蛋白形式对人肾癌细胞株786-O的作用,检测其诱导的肾癌细胞凋亡及其对Bax-Caspase3凋亡通路的影响。方法:构建重组质粒p ET28aCTP-NPRL2和p ET28a-NPRL2并转染大肠杆菌DH5α,从而得到原核表达体系用于CTP-NPRL2融合蛋白及NPRL2蛋白的表达和提取;Western blot验证CTP-NPRL2蛋白和NPRL2蛋白的表达;将肾癌786-O细胞分为2组,分别与等量的NPRL2蛋白和CTP-NPRL2蛋白共培养,采用免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜检测2种蛋白在肾癌细胞786-O的亚细胞定位情况;将在96孔板培养的786-O细胞分为5组,其中4组分别用1.0μmol/L CTP-NPRL2蛋白、2.0μmol/L CTP-NPRL2蛋白、4.0μmol/L CTP-NPRL2蛋白、4.0μmol/L NRPL2蛋白处理,剩余1组为对照组;MTT法检测各组786-O细胞增殖的情况;流式细胞仪分析各组细胞周期和细胞凋亡情况;real-time PCR、Western blot检测各组786-O细胞中Bax和Caspase-3在m RNA及蛋白水平的表达情况。结果:质粒测序结果显示成功构建所需的原核表达载体;Western blot结果显示CTP-NPRL2融合蛋白在原核表达载体中有表达。激光共聚焦显微镜结果提示CTP-NPRL2蛋白导入786-O细胞后定位于胞浆;MTT发现CTP-NPRL2组细胞增殖较NPRL2组及空白对照组受到明显的抑制(P<0.05);流式细胞分析显示,相对于空白对照组和NPRL2组,CTP-NPRL2组的凋亡率显著增高且处于G0/G1期细胞明显增多(P<0.05)。real-time PCR和Western blot结果提示,与空白对照组和NPRL2组比较,CTP-NPRL2组Bax和Caspase-3在m RNA和蛋白质水平的表达均明显上调(P<0.05)。结论:CTP介导抑癌基因NRPL2以CTP-NPRL2融合蛋白形式导入肾癌786-O细胞中并对其有明显的抑制作用,可能通过影响Bax-Caspase3凋亡通路的活性,抑制786-O细胞的增殖,并诱导其凋亡将细胞周期阻滞于G0/G1期,从而发挥抑癌作用。