高生物安全性内皮抑素真核表达载体的构建

摘要

目的:构建具有高度生物安全性的人内皮抑素(Endostatin)真核表达载体,为抗血管生成剂转基因治疗肿瘤奠定实验基础。方法:采用被FDA批准的可用于人体实验的真核表达质粒pVAX1为载体,PCR扩增带有人IgGγ链信号肽序列的Endostatin基因,KpnI、EcoRI双酶切载体和PCR产物,T4DNA连接酶连接,构建重组表达载体,命名为pVAX鄄sEN。重组子经KpnI、EcoRI双酶切、PCR及测序鉴定。将测序正确的重组载体经脂质体转染体外培养的人肝癌细胞系(HepG2),用RT鄄PCR、ELISA方法鉴定Endostatin的表达。结果:PCR获得了610bp带有信号肽的Endostatin基因,测序结果表明,正确构建了含有信号肽及Endostatin的真核表达载体pVAX鄄sEN。重组子转染HepG2细胞72h后,RT鄄PCR显示有EndostatinmRNA表达。ELISA证实,转染重组载体的HepG2细胞上清有目的蛋白的高效表达,表达量为172.34ng/ml。结论:成功构建了高生物安全性真核表达载体pVAX鄄sEN,为肝癌等实体瘤的基因治疗研究奠定了基础。