六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗黑色素瘤增效作用的缝隙连接机制初探

摘要

目的探讨六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞增效作用的缝隙连接机制。方法制备六味地黄丸含药血清(分别为2.5%、5.0%、10.0%六味血清)及10.0%对照血清。采用RT-PCR法检测六味地黄丸含药血清对B16细胞株的缝隙链接蛋白(Cx)26和Cx43 mRNA的影响,Western blot法和间接免疫荧光法检测其对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响;RT-PCR检测Cx26-309、Cx26-337、Cx26-367、Cx26-2098 SiRNA对Cx26的干扰效率,选用干扰效率最高的Cx26-2098 SiRNA干扰Cx26基因后观察六味地黄丸联合HSV-tk/GCV的旁观者效应;MTT法检测细胞间缝隙连接通讯功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)抑制剂甘草次酸(GA)对六味地黄丸联合tk/GCV系统对B16细胞杀伤作用的影响,实验设为对照血清组,2.5%、5.0%、10.0%六味血清组(简称低、中、高剂量组)及对照血清联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV加GA组。GCV终浓度为20mol/L,GA终浓度为50mol/L。结果六味地黄丸含药血清能提高B16细胞中Cx43mRNA及蛋白的表达,且具有量效依赖关系;对Cx26 mRNA与蛋白的表达具有双向调节作用,低剂量时具有抑制作用而高剂量是能上调其表达;SiRNA干扰Cx26基因表达后,六味地黄丸联合自杀基因治疗的旁观者效应与没有干扰前比较无明显的变化;低、中、高剂量联合GCV组在GA阻断前细胞抑制率(48.75%、59.39%、69.28%)与阻断后细胞抑制率(29.14%、38.71%、58.13%)比较,显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤恶性黑色素瘤B16细胞的增效作用与缝隙连接机制有关,可能是通过提高Cx26和Cx43等缝隙连接蛋白表达而达到协同增效作用。