六味地黄丸含药血清对肝癌自杀基因治疗旁杀伤的增效作用

摘要

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后差。随着分子生物学的发展，基因治疗给恶性肿瘤的治疗带来了曙光。肿瘤的基因治疗，特别是肿瘤的自杀基因疗法，已经成为继传统的手术切除、放疗、化疗等方法后的一种新的抗肿瘤治疗措施。但单纯自杀基因治疗由于目前载体转染效率较低、靶向性不够等问题没解决，仍有部分肿瘤细胞残余导致肿瘤复发，这是该疗法存在的重大缺陷。因而增强旁杀伤效应目前已成为提高肿瘤自杀基因治疗疗效的重要策略。由于缝隙连接机制是旁观者效应的重要机制，故改善肿瘤的细胞间信息交流(GJIC)是自杀基因疗法增效的重要途径之一。同时，以往的研究证明：六味地黄丸有提高cAMP的作用，而cAMP的提高又能增加Cx蛋白的表达，从而提高GJIC功能而增强自杀基因治疗的旁杀伤效应。 本研究应用中药复方血清药理学的方法将自杀基因HSV1-tk/GCV系统与六味地黄丸在体外实验中联合，以大鼠肝癌细胞CBRH7919为对象进行了初步研究。通过研究以期为临床自杀基因疗法联合中药复方的中西医结合治疗方案的建立提供实验数据、科学依据及前期工作基础。 目的：本实验旨在以往研究的基础上，应用中药复方血清药理学方法将六昧地黄丸和HSV1-tk/GCV系统联合，进行大鼠肝癌细胞CBRH7919自杀基因治疗的体外实验。初步探讨其机制，为建立中西医结合肿瘤基因治疗方案提供必要条件。 方法： 1.六味地黄丸药物血清和空白血清的制备：SD大鼠(230～280g)，分为对照组和六味地黄丸给药组(药物剂量为等效剂量的6～8倍)。灌胃又分为四天血清组和八天血清组。末次给药后1小时腹主动脉取血，-70℃冰箱保存备用。 2. HSV1-tk/GCV自杀基因系统的构建(导师课题组在前期工作中已经完成) 3. HSV1-tk/GCV系统联合六味地黄丸含药血清治疗疗效观察：MTT法检测大鼠肝癌细胞CBRH7919对GCV的敏感性以及对大鼠血清(对照血清和六味地黄丸含药血清)的敏感程度，以确定用药浓度。选择对细胞抑制率低的浓度进行实验。用金正钧Q值分析六味地黄丸含药血清与自杀基因系统联合作用对旁杀伤效应是否具有协同性。Q值为联合用药时实测药效与理论药效的比值，Q<0.85为拮抗作用；0.85≤Q<1.15为相加作用；Q≥1.15为协同作用。 4.六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗系统旁杀伤增效机制的研究：用流式细胞技术检测凋亡指数;SLDT法观察六味地黄丸含药血清对CBRH7919的GJIC功能的影响。 结论：本研究在细胞水平探讨了六味地黄丸含药血清增强自杀基因疗法疗效的可行性。发现能有效增强自杀基因对肿瘤细胞的杀伤力，提高旁杀伤效应，而且是协同性增效作用。对其机制研究分析表明，其作用机制很可能是通过增强CBRH7919细胞的GJIC或诱导凋亡等来起到增效作用的，也可能是两个机制都起作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分 研究背景及立题依据

1研究背景

2立题依据

第二部分 实验研究及结果分析

第一章 CBRH7919细胞的培养

1材料

2各种试剂的配制

3方法

4讨论

第二章 CBRH7919/tk+细胞对GCV的敏感性及旁杀伤效应的观察

1材料

2方法

3结果

4讨论

第三章 对照血清和含药血清的制备及血清添加量的确定

1材料

2方法

3结果

4讨论

第四章 HSV1-tk/GCV治疗实验中tk+：tk-细胞最佳比例的确定

1材料

2方法

3结果

4讨论

第五章 六味地黄丸含药血清对tk+/GCV系统旁杀伤增效作用的量效关系

1材料

2方法

3结果

4讨论

第六章 六味地黄丸含药血清联合tk+/GCV系统对CBRH7919细胞周期和凋亡的影响

1材料

2方法

3结果

4讨论

第七章 六味地黄丸含药血清对CBRH7919细胞的缝隙连接机制初探

1材料

2方法

3结果

4讨论

第三部分 研究总结

参考文献

附录

致谢