pri-mir-302/367重组慢病毒载体的构建及其下游调节基因的鉴定

摘要

目的:构建可诱导表达pri-mir-302/367的慢病毒载体,并研究miR-302/367家族基因miR-302a/b/c/d和miR-367及其下游调节基因OCT4、SOX2和NANOG在HeLa细胞中的诱导性表达。方法:以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增pri-mir-302/367基因。经双酶切后连接入pLV-TRE质粒,构建pLV-TRE-302慢病毒重组体,酶切及测序予以鉴定。将重组质粒和辅助质粒共同转染293 FT细胞,并测定病毒滴度。用病毒转染HeLa细胞,强力霉素(doxycline,DOX)诱导后,通过real-time PCR测定miR-302/367家族基因及其下游调节基因的表达。实验分为诱导组(DOX+)、非诱导组(DOX-)和空白组(blank)。结果:酶切及测序证实重组慢病毒载体pri-mir-302/367构建成功,病毒滴度为5×106TU/ml;DOX诱导72 h后,real-time PCR结果显示诱导组高于非诱导组和空白组(P0.05,其中miR-302a:P blank vs.DOX-=0.057;miR-302b:P blank vs.DOX-=0.832;miR-302c:P blank vs.DOX-=0.445;miR-302d:P blank vs.DOX-=0.979;miR-367:P blank vs.DOX-=0.161;OCT4:P blank vs.DOX-=0.051;SOX2:P blank vs.DOX-=0.060;NANOG:P blank vs.DOX-=0.078)。结论:成功构建了携带人miR-302/367可控性慢病毒载体,为后续的重编程研究奠定了实验基础。