三穗麻鸭ADF基因序列分析及其荧光定量PCR方法建立

摘要

为探究三穗麻鸭肌动蛋白解聚因子(ADF)基因生物学功能及其在各组织中的转录水平,根据GenBank预测的ADF基因序列设计特异性引物,以40日龄健康三穗麻鸭脑、心脏及肝脏总RNA提取样本反转录为cDNA,进行PCR扩增、克隆质粒构建及序列测定,对测定序列进行同源性比对及生物信息学分析。根据ADF基因测定序列设计特异性引物,以克隆质粒为模板建立三穗麻鸭ADF基因荧光定量PCR检测方法并进行特异性、重复性和敏感性试验,利用建立的方法检测三穗麻鸭组织ADF基因转录水平。结果表明:三穗麻鸭ADF基因完整CDS序列为498 bp,与斑胸草雀ADF基因同源性最高(95.4%),与非洲爪蟾蜍ADF基因同源性最低(54.1%);三穗麻鸭ADF基因共编码165个氨基酸,理论成熟蛋白质分子质量约为18.53 ku,等电点为8.14,总平均亲水指数为-0.242;建立的三穗麻鸭ADF荧光定量PCR方法标准曲线呈典型的S型,方程为y=-2.413x+25.061,扩增效率为159.6%,相关系数为0.991;熔解曲线呈特异性单峰,批内、批间重复变异系数分别小于2%和3%,最低检出量为1.939×101 copies·μL-1,是普通PCR方法的1000倍,表明所建方法具有特异性强、重复性好和敏感性高的优点;三穗麻鸭各组织均可检出ADF基因,脑中ADF基因转录水平最高且与其他组织差异极显著。该研究成功克隆三穗麻鸭ADF基因并建立了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,为后续该基因的相关研究奠定了基础。