蓝氏贾第鞭毛虫沉默信息调节因子2(Sir2)基因的克隆、表达与纯化

摘要

目的获取蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,Gl)沉默信息调节因子2(Sir2)基因序列及其重组蛋白。方法以蓝氏贾第鞭毛虫中国C2克隆株基因组DNA为模板,PCR扩增GlSir2基因编码序列,将所得片段连接至pMD-19T质粒。转化大肠埃希菌(E.coli)JM109,挑取阳性克隆进行测序。将GlSir2基因插入原核表达载体pET28b,构建表达载体pET28b-GlSir2,转化E.coli BL21(DE3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况。收集重组表达产物,用8 mol/L尿素溶解包涵体并收集上清,镍离子亲和层析进行纯化。将纯化产物透析复性,蛋白质印迹(Western blotting)进行免疫学鉴定。结果获得了蓝氏贾第鞭毛虫中国C2克隆株GlSir2基因编码序列,该序列包含一个1 680 bp的开放阅读框架,可编码559个氨基酸,预测其蛋白的相对分子质量(Mr)约为62 800。构建表达载体pET28b-GlSir2,经IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式表达。溶解包涵体并经纯化后的目的蛋白纯度达80%以上,经透析复性后获得可溶蛋白。Western blotting分析显示,该重组蛋白可被His标签抗体识别。结论克隆了蓝氏贾第鞭毛虫GlSir2基因编码序列,并获得重组表达,重组蛋白可被His标签抗体识别。