人自身抗原CYP2D6 285 bp基因片段克隆、真核表达及免疫性鉴定

摘要

目的:真核表达人自身抗原细胞色素P450 2D6(CYP2D6)显性表位285 bp基因片段,获得具免疫学活性的纯化重组蛋白,为自身免疫性肝炎抗体的检测提供特异性抗原．方法:以肝脏的cDNA混合文库为模板作 PCR,将PCR产物与真核表达载体pEGH共同转化酿酒酵母Y258,碱裂解法进行质粒制备, PCR扩增鉴定．表达载体构建成功后,在半乳糖的诱导下表达产生重组融合蛋白,利用 GST亲和层析法进行纯化．然后对其产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)和蛋白质印迹法(WB)及蛋白质质谱学 (MALDI-TOF)检测．结果:PCR产物约290 bp,与预期285 bp接近． pEGH-CYP2D6重组阳性克隆PCR鉴定与预期大小接近,SDS-PAGE和WB结果显示,融合蛋白Mr37 000,具有天然人自身抗原CYP2D6 的免疫原性．质谱蛋白肽指纹数据通过Mascot 在人类蛋白质数据库中分析比对,与CYP2D6 蛋白同源性最高．结论:成功克隆表达人自身抗原CYP2D6的显性表位,为建立新的自身免疫性肝炎抗体检测方法奠定了基础．