胞嘧啶脱氨酶基因突变体D314A对人结肠癌细胞的抑制作用

摘要

目的:构建大肠埃希菌胞嘧啶脱氨酶(E.colicytosine deaminase,EC-CD)基因突变体D314A(即EC-CD基因开放阅读框第314位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸)并研究其抗肿瘤作用。方法:构建含EC-CD基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CDwt,应用点突变技术将pcDNA3.1-CD中EC-CD基因开放阅读框第314位氨基酸的碱基由A突变为C,即构成pcDNA3.1-CDD314A。用LipofectamineTM2000将EC-CD基因或D314A基因转入人结肠癌细胞系LoVo细胞,以G418筛选出稳定表达的阳性克隆LoVo-CDwt及LoVo-CDD314A。应用MTT法检测EC-CD基因及D314A基因对LoVo细胞的直接杀伤作用及旁观者效应。结果:成功构建EC-CD基因突变体D314A并经测序确认。LoVo细胞转染EC-CD基因及D314A基因后均能表达相应的mRNA,Lovo-CDD314A细胞对5-FC的IC50为(85.13±0.60)mmol/L,显著低于LoVo-CDwt细胞的(689.76±0.45)μmol/L,(P=0.000);在旁观者试验中,当LoVo-CDwt细胞和LoVo-CDD314A细胞比例均为30%时,细胞存活率分别为(48.5±0.49)%与(17.3±0.40)%(P=0.000)。结论:EC-CD基因突变体D314A的抗LoVo细胞作用显著强于野生型EC-CD基因,有望成为新的肿瘤基因治疗候选基因。