PCR法快速筛选重组克隆方法的改进

摘要

①目的　以PCR法在菌液中快速筛选重组克隆。②方法　提取小鼠巨噬细胞总RNA ,反转录PCR(RT PCR)获得肿瘤坏死因子 α(TNF α)基因片段 ,TA克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌JM10 9。在大肠杆菌培养中的不同时间取样测定大肠杆菌A60 0 值及计数。以不同数量的大肠杆菌为模板进行系列PCR扩增 ,获得适宜PCR扩增条件的大肠杆菌数。③结果　以菌液为模板进行PCR能够快速筛选重组体 ,大肠杆菌模板数在 12 5～ 2 5 0个范围内 ,PCR对阳性克隆的扩增可获得良好结果 ;获得常规培养条件下转化大肠杆菌的生长曲线 ,A60 0 值与大肠杆菌计数间存在显著正相关 (r=0 .93,P <0 .0 0 1)。④结论　通过测定大肠杆菌培养液A60 0 值推算大肠杆菌数量 ,以适宜的大肠杆菌模板行PCR法筛选重组克隆 。