大鼠5-脂肪氧合酶cDNA的重组腺病毒制备及在大鼠血管外膜成纤维细胞中的表达

摘要

目的 利用细菌内同源重组法快速构建携带大鼠5-脂肪氧合酶(5-lipoxygenase,5-LO)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达大鼠5-LO的重组腺病毒,并在大鼠原代血管外膜成纤维细胞中实现过表达.方法 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增大鼠5-LOcDNA片段,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,构建成转移质粒pshuttle-CMV-5LO;用PmeI线性化的pshuttle-CMV-5LO转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,通过同源重组获得阳性重组质粒pAdEasy-1-5LO.重组质粒经鉴定后用PacI酶切,转入HEK293细胞,包装成重组腺病毒Ad-1-5LO,经纯化,鉴定,滴度测定,转染体外培养的大鼠原代血管外膜成纤维细胞,Western blot检测腺病毒载体在体外的过表达.结果 5-LOcDNA成功地插入到穿梭质粒中,pshuttle-CMV-5LO与pAdEasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-1-5LO,重组腺病毒经PCR和酶切鉴定表明携带有目的基因5-LOcDNA,滴度约为1.0×1015 pfu/L,转染大鼠原代血管外膜成纤维细胞后经Western blot检测,细胞内5-LO的表达明显增加.结论 细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-1-5LO实现了在血管外膜成纤维细胞中的过表达,为研究5-LO途径在血管重构中的作用奠定了基础.