神经毒力体外评价方法的建立及减毒活疫苗的体外评价

摘要

目的通过构建原代大鼠神经细胞混合培养模型,体外评价减毒活疫苗的神经毒力作用。方法取1~3日龄SD大鼠大脑组织,无菌分离获得神经细胞,于DMEM/F12培养基5%CO2培养箱培养7~9 d至混合培养体系稳定。Anti-MAP2、Anti-GFAP抗体免疫细胞技术鉴定神经元、星形胶质细胞。细胞分组:空白对照组,高、中、低剂量非疫苗对照组(β-淀粉酶和长春新碱)、麻疹减毒活疫苗组、腮腺炎减毒活疫苗组、吸附无细胞百白破灭活脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗(简称联合疫苗)组。CCK8增殖毒性试验检测细胞活力;免疫荧光标记GFAP、MAP2观察神经细胞形态学变化;ELISA法检测细胞培养上清中促炎性细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6浓度。结果原代神经细胞混合培养体系由约50%GFAP(+)星形胶质细胞和约50%MAP-2(+)神经元组成。联合疫苗、长春新碱给药各时间点存在剂量效应关系,麻疹疫苗、腮腺炎疫苗未见细胞毒性。联合疫苗、长春新碱各剂量组神经细胞存活率降低,神经细胞胞体变形,核浆比增大;麻疹疫苗、腮腺炎疫苗各剂量组神经细胞密度和形态未见异常;β-淀粉酶各剂量组未见细胞毒性和形态学改变。联合疫苗和β-淀粉酶组神经细胞培养上清中IL-1β、TNFα浓度显著升高,麻疹疫苗组IL-6浓度显著升高。结论构建了原代大鼠神经细胞培养模型,可用于体外评价减毒活疫苗的神经毒力作用。麻疹和腮腺炎减毒活疫苗未见神经细胞毒性作用。联合疫苗、麻疹疫苗和β-淀粉酶作用于神经细胞与潜在的神经炎症反应发生相关。长春新碱可见神经细胞毒性作用,但未见促炎性细胞因子IL-1β、TNFα、IL-6的显著性改变。