猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

摘要

根据GenBank登录的猪肺炎支原体黏附素P97基因(U50901)序列,设计1对特异性引物和1条探针,优化了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法。25μL反应体系,引物MhpF/MhpR(20μmol/L)各0.5μL,探针MhpP(20μmol/L)0.5μL为反应最佳工作浓度,标准曲线Ct值和模板启始浓度的log值之间的线性相关系数为0.997。特异性、敏感性和重复性检测结果显示,该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒,猪细小病毒、猪圆环病毒等病原检测无交叉反应;针对猪肺炎支原体阳性质粒标准品检测,灵敏度可以达到10拷贝;重复性检测Ct值变异系数在0.78%～1.16%之间。用建立的实时荧光定量PCR检测方法,对40份临床样品检测,结果表明肺脏拭子与肺脏悬液阳性率完全一致,而鼻腔拭子检出率较低。