猪肺炎支原体荧光定量PCR检测方法的建立及应用

摘要

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是引起猪气喘病(Mycoplasma pneumoniae of swine，MPS)的主要病原，也是猪呼吸道综合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）的主要原发性病原之一。MPS是一种慢性的、传播性强的且在世界各地广泛分布的疾病，主要导致患猪生长缓慢、饲料转化率低并常常引起其他病原的继发感染，给养猪业造成巨大的损失。针对MPS的诊断方法，包括临床诊断、病理组织学诊断和实验室诊断方面的诊断方法，目前Mhp的诊断主要方法有分离培养法、免疫荧光法、核酸探针法以及聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)等，在当今规模化猪场中，猪感染后多呈慢性或隐性感染，这些方法虽然可以对病原做出诊断，但存在费时费力、代价高、敏感性和特异性不够理想等缺点。近年来，国内外开始利用荧光定量PCR技术检测猪肺炎支原体并对猪肺炎支原体进行精确定量的研究，但对以TaqMan荧光定量PCR定性定量检测Mhp的研究还比较少。
　　 目前研究较多的的猪肺炎支原体蛋白基因有P36、P46、P65、P97等，基于纤毛粘附因子P97是Mhp引起猪地方性肺炎的主要蛋白因子，本研究根据GenBank公布的Mhp P97基因序列，设计合成了特异性引物，PCR扩增Mhp168株的P97基因序列，克隆入pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18-T/P97，经测序鉴定为标准阳性质粒。根据阳性质粒的拷贝数，建立标准曲线，标准样品浓度的对数与C值之间的线性关系方程为Y(Ct)=-3.41X+42.549;在国内首先建立了以P97为靶基因序列的TaqMan荧光定量PCR检测方法。通过测定Mhp菌液拷贝数后，将Mhp DNA进行10倍比稀释，以此来检测TaqMan荧光定量PCR检测方法的敏感性，敏感性达8.3 copy/μL;通过与其他菌株进行TaqMan荧光定量PCR扩增比较，Mhp与其它病原无交叉感染，特异性良好;稀释后以不同浓度的质粒进行荧光定量PCR扩增，重复性良好，此方法可用于猪肺炎支原体培养物和组织样品的快速定量检测。
　　 在此基础上，将TaqMan荧光定量PCR检测方法应用于临床实践中，通过定量检测灭活前后猪肺炎支原体疫苗中Mhp基因含量，发现Mhp含量无显著变化，说明灭活不影响疫苗中Mhp基因含量;通过检测猪肺炎支原体在攻毒猪体内各组织的分布，发现猪肺炎支原体在呼吸器官含量最多，约为106 copy/μL，而在其他组织分布较少，如在小肠、肌肉、脑、肝、心等组织中含量约为102 copy/μL甚至更少，在肾、淋巴结中则无;采取43份猪肺组织，比较荧光定量PCR检测法与套式PCR检测法检测效果，荧光定量PCR检出率100％，套式PCR检出率为79％，验证了本试验中所建立的荧光定量PCR检测方法敏感性高于套式PCR;通过检测猪场病变猪肺组织中Mhp含量变化，可了解整个猪场感染Mhp的情况。
　　 这些均验证了所建立的TaqMan荧光定量PCR检测猪肺炎支原体方法能较好地运用于临床试验中。

目录

声明

摘要

缩略语及符号

第一章 文献综述

1 病原学特点

1．1 细胞学特性

1．2 生物学特性

2 流行病学

3 致病机理

4 诊断学方法

4．1 病原分离培养

4．2 血清学诊断方法

4．3 分子生物学诊断方法

5 问题及展望

第二章 猪肺炎支原体荧光定量PCR检测方法的建立

1 材料

1．1 菌株及质粒载体

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 主要溶液配方

2 方法

2．1 引物设计与合成

2．2 猪肺炎支原体的培养

2．3 Mhp模板的制备

2．4 Mhp P97基因的PCR扩增

2．5 目的基因的回收

2．6 Mhp P97基因与pMD18-T载体连接

2．7 连接产物的转化

2．8 重组质粒DNA的提取、鉴定及测序

2．9 荧光定量PCR检测方法的建立

3 结果与分析

3．1 猪肺炎支原体P97常规PCR退火温度的优化

3．2 猪肺炎支原体P97片段扩增结果

3．3 猪肺炎支原体P97片段回收结果

3．4 重组质粒pMD18-T／P97的鉴定

3．5 质粒测序结果

3．6 标准曲线的建立

3．7 敏感性的检测

3．8 特异性检测

3．9 重复性检测

4 讨论

5 小结

第三章 猪肺炎支原体实时荧光定量PCR探针方法的应用

1 材料

1．1 菌种及组织材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 试剂配方

2 方法

2．1 PCR反应中引物的设计及合成

2．2 猪肺炎支原体的培养

2．3 含猪肺炎支原体P97片段的质粒的提取

2．4 猪肺炎支原体模板的提取

2．5 Taqman Real-Time PCR反应体系及反应条件

2．6 套式PCR反应体系及反应条件

2．7 TaqMan荧光定量PCR检测临床样品

3 结果与分析

3．1 检测灭活前后猪肺炎支原体菌液中Mhp含量变化

3．2 猪肺炎支原体在攻毒猪不同组织中的分布

3．3 比较荧光定量PCR与套式PCR检测猪肺组织的敏感性

3．4 检测猪场病变猪肺组织中Mhp含量

4 讨论

4．1 检测灭活前后Mhp菌体中Mhp含量

4．2 检测攻毒Mhp猪体内Mhp的分布

4．3 比较荧光定量PCR与套式PCR检测的意义

4．4 检测猪场中感染Mhp情况的意义

5 小结

全文总结

参考文献

致谢