重叠延伸PCR技术在单碱基定点突变中的作用

摘要

氨基酸通透酶(amino acid permease,AAPs)是一种跨膜转运蛋白,广泛参与植物体内氨基酸的吸收与转运。本试验通过重叠延伸PCR技术对氨基酸通透酶基因进行单碱基定点突变,以便为今后研究植物对外源氮的吸收与利用率奠定基础。本研究根据Tair数据库中拟南芥AtAAP1基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计含有1个突变位点的2对互补的定点突变引物和1对带有pCAMBIA3301-GFP载体的多克隆位点的接头引物,以野生型拟南芥叶片的cDNA为模板,进行3次PCR扩增,将获得的突变基因片段连接到pCAMBIA3301-GFP载体上,转化DH5α感受态细胞。将筛选的阳性菌株送至公司测序,测序结果表明拟南芥AtAAP1基因的第908位碱基A突变为T,实现了单碱基定点突变,这与预计结果相同,说明成功依靠重叠延伸PCR技术做到目的基因的定点突变。该技术能方便快速地获得定点突变序列,为进一步研究AtAAP1基因的功能奠定了基础。