鼠B7-H4基因重组腺病毒的构建及其在B16F10细胞中的表达、鉴定

摘要

目的构建表达鼠B7-H4的重组腺病毒并检测其在B16F10细胞中的表达.方法采用RT-PCR技术,取小鼠肺脏, TriPure提取肺脏总RNA,反转录得到cDNA序列,PCR扩增B7-H4全长,克隆到plenti6/V5克隆载体中并经过测序证实与标准序列一致.加入适当的酶切位点,双酶切PCR扩增产物连接入pAd track CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAd track CMV mB7-H4,经酶切线性化后, 用CaCl2的方法转化到含有腺病毒骨架质粒pAd Easy的BJ 5183大肠杆菌中,挑选同源重组菌落提取质粒,酶切线性化重组质粒并转染293 细胞,包装成重组病毒颗粒.重组病毒上清感染B16F10细胞,并用PE标记的B7-H4单克隆抗体检测B16F10细胞mB7-H4蛋白的表达.结果 RT-PCR扩增得到含编码mB7-H4的860 bp基因片段,与预期大小一致,并经过测序证实与标准序列一致.成功构建了mB7-H4重组腺病毒,病毒滴度达到3×1013 pfu/ml,pAd mB7-H4重组腺病毒表达载体感染B16F10细胞后,荧光显微镜观察显示PE标记的mB7-H4单克隆抗体染色B16F10细胞阳性. 结论成功构建了mB7-H4重组腺病毒,转染B16F10细胞后表达出有活性的B7-H4蛋白,为进一步研究B7-H4分子在器官移植、自身免疫性疾病以及肿瘤逃逸机制中的作用奠定了基础.