布鲁氏菌OMP25与OMP31蛋白的表达及其间接ELISA诊断试剂盒研制

摘要

目的 为建立布鲁氏杆菌间接ELISA检测方法.方法 本研究根据GenBank中已登录猪种布鲁氏菌S2株全基因组序列,分别针对omp25和omp31设计一对引物,分别扩增并回收573 bp与783 bp目的基因片段,将其分别克隆入pET-28a原核表达载体中,构建重组质粒pET-OMP25与pET-OMP31,进行酶切鉴定与基因序列测定后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导表达,OMP25与OMP31蛋白主要以包涵体形式存在;将目的蛋白纯化,应用Western blot进行蛋白活性的检测.结果 纯化的目的蛋白具有良好的免疫学活性.以纯化的重组蛋白为包被抗原,在确定了OMP25与OMP31蛋白最佳配比为4∶1、抗原最佳包被浓度为10μg/mL、血清的最佳稀释倍数为1∶50倍稀释、临界值为0.314的基础上,建立羊布鲁氏菌病抗体间接ELISA诊断方法并组装成诊断试剂盒,并将试剂盒进行了特异性、敏感性、重复性、符合率试验、血清交叉反应性等检测.结论 研制的羊布鲁氏菌病抗体ELISA诊断试剂盒具有良好的特异性、敏感性,可重复性,可应用于临床样本检测.