布鲁氏菌SOD、L7/L12、OMP25、OMP31蛋白DNA疫苗的构建及对小鼠免疫原性的分析

摘要

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌(Brucella)引起的人畜共患病。布鲁氏菌的宿主范围主要包括家畜、家禽、野生动物以及人，能够引起发热、流产与不育、慢性关节炎和神经损害等症状。世界上多个国家和地区有布鲁氏菌病的存在，造成了巨大的经济损失。因此，布鲁氏菌病的预防工作是非常重要的，采用疫苗接种的方式是防治布鲁氏菌病的重要方法。
　　 本研究中，以B.melitensis强毒株M28为模板，PCR分别扩增SOD、L7/L12、OMP25、OMP31基因，产物经回收纯化、EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后，克隆至pCAGG质粒中，构建真核表达质粒pCAGG-SOD、pCAGG-L7/L12、pCAGG-OMP25、pCAGG-OMP31。然后，将B.melitensis强毒株M28的SOD和OMP25基因经PCR扩增，克隆至pET-32a质粒的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，构建重组表达质粒pET-SOD和pET-OMP25。pET-SOD和pET-OMP25质粒分别在BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达，镍琼脂糖凝胶亲和层析分离重组SOD蛋白(rSOD)和重组OMP25蛋白(rOMP25)。
　　 小鼠免疫实验中，用上述四种质粒pCAGG-SOD、pCAGG-L7/L12、pCAGG-OMP25、pCAGG-OMP31（DNA组）联合免疫BALB/c小鼠，同时设置弱毒疫苗M5-90组、PBS组、pCAGG组作为三组对照。通过利用间接ELISA实验的方法，对免疫小鼠血清中特异性抗体水平进行检测;进而，通过利用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和流式细胞术(FCM)的实验方法，对免疫小鼠的细胞免疫水平进行检测。
　　 本研究结果显示，rSOD和rOMP25蛋白分子量分别为34ku和43ku;间接EHSA结果表明DNA组特异性IgG抗体水平显著高于M5-90组(p＜0.05);ELISPOT结果表明DNA组分泌IFN-γ的细胞数目显著高于M5-90组;FCM结果表明DNA疫苗和M5-90免疫小鼠能够引起小鼠CD4+T和CD8+T细胞含量升高，DNA组小鼠CD4+T和CD8+T细胞含量升高更明显。
　　 综上，编码布鲁氏菌SOD、L7/L12、OMP25、OMP31基因的DNA疫苗能够诱导小鼠产生特异性体液免疫反应和细胞免疫反应，此DNA疫苗有望作为预防布鲁氏菌病的候选疫苗。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 布鲁氏菌简介

1．2 布鲁氏菌病流行病学

1．3 布鲁氏菌病原学

1．4 布鲁氏菌病临床症状

1．5 布鲁氏菌病诊断方法

1．5．1 细菌学鉴定

1．5．2 核酸鉴定

1．5．3 凝集试验

1．5．4 ELISA

1．5．5 FPA

1．5．6 免疫胶体金技术

1．6 布鲁氏菌病疫苗研究

1．6．1 Rev．1

1．6．2 S2

1．6．3 M5

1．6．4 S19

1．6．5 灭活疫苗

1．6．6 突变株疫苗

1．6．7 DNA疫苗

1．7 布鲁氏菌抗原和毒力相关基因

1．7．1 L7／L12蛋白

1．7．2 外膜蛋白

1．7．3 毒力基因

1．8 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株、质粒、重组蛋白

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要试剂及仪器

2．1．4 主要试剂的配制

2．2 试验方法

2．2．1 真核表达质粒的构建

2．2．2 蛋白表达及纯化

2．2．3 小鼠接种试验

2．2．4 间接ELISA检测血清抗体水平

2．2．5 小鼠脾脏淋巴细胞的制备

2．2．6 酶联免疫斑点试验(ELISPOT)

2．2．7 流式细胞计数器检测

3 结果与分析

3．1 真核表达质粒构建结果

3．1．1 SOD基因的扩增及pCAGG-SOD酶切鉴定

3．1．2 L7／L12基因的扩增及pCAGG—L7／L12酶切鉴定

3．1．3 OMP25基因的扩增及pCAGG-OMP25酶切鉴定

3．1．4 OMP31基因的扩增及pCAGG-OMP31酶切鉴定

3．2 蛋白表达及纯化

3．2．1 目的基因的扩增与重组质粒的鉴定

3．2．2 重组蛋白的表达及纯化

3．3 间接ELISA检测血清抗体水平

3．4 酶联免疫斑点实验

3．5 流式细胞计数器检测结果

3．5．1 CD8+T结果

3．5．2 CD4+T结果

4 讨论

4．1 DNA疫苗的构建

4．2 表达载体的选择

4．3 间接ELISA结果分析

4．4 ELISPOT结果分析

4．5 FCM结果分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文