布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12与BLS蛋白的融合表达及免疫原性研究

摘要

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由革兰氏阴性细菌布鲁氏菌属(Brucella)的病原菌感染而引起的一种人畜共患性动物传染疾病。人在感染该病后的主要症状是持续性发热、关节炎、肝脾肿大等,动物感染该病后除上述症状外,在反刍动物中还常造成流产、不孕不育和组织坏死等严重的后果。进入21世纪以来,布鲁氏菌病在我国感染人数和发病率一直处于较高的位置,在畜牧业当中也出现了明显的区域感染回升现象。布鲁氏菌病已经成为严重威胁人类身体健康和阻碍社会经济发展的重要因素之一。目前,布鲁氏菌病在世界范围内尚无彻底治愈的先例,防控布鲁氏菌病疫情的最有效措施依然是通过疫苗接种进行免疫预防。
　　本文以布鲁氏菌核糖体蛋白基因L7/L12和布鲁氏菌2,4-二氧四氢蝶啶合酶基因bls为研究对象,以猪种布鲁氏菌疫苗S2弱毒活疫苗菌株的全基因组DNA为模板,分别设计克隆引物和融合引物克隆目的基因L7/L12以及L7/L12和bls。将用融合引物克隆得到的L7/L12和bls基因片段利用融合PCR技术进行融合,得到融合基因L7/L12-bls。将L7/L12基因插入到pET-28a质粒载体中,构建成功pET-28a-L7/L12重组质粒,经PCR检测和测序鉴定正确后,导入到大肠杆菌TL129表达菌株,IPTG诱导表达L7/L12蛋白。融合基因L7/L12-bls经双酶切及纯化处理后克隆至pET-28a质粒载体中,构建pET-28a-L7/L12-bls重组质粒,经PCR和双酶切检测,并经测序鉴定正确后,导入大肠杆菌TL129表达菌株,IPTG诱导表达L7/L12-BLS融合蛋白。经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(SDS-PAGE)检测分析,重组核糖体蛋白L7/L12和重组融合蛋白L7/L12-BLS均以部分水溶性蛋白形式表达。在经过镍柱亲和层析纯化后,得到纯化的分子量大小分别为19.3kDa和35.8kDa的两种蛋白。
　　将纯化后的蛋白进行浓度测定,经稀释得到浓度为1mg/ml的蛋白样品。以PBS作为空白对照,将两种蛋白分别免疫长耳家兔。在获得两组抗血清后,分别利用两种纯化的蛋白抗原通过Western blot技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)技术检测抗血清免疫效果。结果显示:两种蛋白都能与相应的抗血清发生特异性免疫反应,而对照组的PBST和ABS不能与抗血清发生免疫反应,并且,BLS蛋白对L7/L12蛋白的免疫原性有至少2至5倍以上的增强作用。本试验为进一步研制布鲁氏菌基因疫苗和重组亚单位疫苗提供了理论依据和实验参考。

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引言

1 文献综述

1.1布鲁氏菌概述

1.2布鲁氏菌的研究进展

1.3布鲁氏菌病疫苗的研究进展及研究意义

1.4本文的研究内容及研究意义

2 L7/L12蛋白的制备与鉴定

2.1实验材料和实验器材

2.2试验方法

2.3试验结果

2.4结果和讨论

3L7/L12-BLS融合蛋白的制备与鉴定

3.1实验材料和实验器材

3.2试验方法

3.3试验结果

3.4 结果和讨论

4 L7/L12蛋白和L7/L12-BLS融合蛋白的免疫原性研究

4.1实验材料和实验器材

4.2试验方法

4.3试验结果

4.4结果及讨论

参考文献

在学研究成果

致谢