弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3的构建

摘要

目的构建弓形虫P24(TgP24)基因敲除转染质粒pGB/P5-P3(GRA2/ Ble-P24 5'UTR-P24 3,UTR),为TgP24基因敲除奠定基础.方法根据TgP24基因序列,设计并合成两对特异引物 (P1 to P4),采用PCR技术特异扩增TgP24基因的5,端非翻译区2.5 kb片段(P24 5'UTR)和3'端非翻译区2.89 kb片段(P24 3'UTR),将其分别亚克隆入pCR2.1-TOPO TA载体,构建质粒P24 5'UTR/TA和P24 3'UTR/TA;重组质粒P24 5'UTR/TA经KpnⅠ和BglⅡ双酶切后,再将纯化的P24 5'UTR片段亚克隆入转染质粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ位点,构建重组质粒pGB-P5(GRA2/Ble-P24 5'UTR);重组质粒P24 3'UTR/TA经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后,纯化P24 3'UTR片段,再将其定向克隆到重组质粒pGB-P5的BamHⅠ和NotⅠ位点,从而构建弓形虫TgP24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3.重组质粒经DNA序列测定证实目的片段插入正确.结果经过PCR筛选、限制性酶切及DNA测序鉴定,证实P24 5'UTR和P24 3'UTR两片段正确插入质粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ及BamHⅠ和NotⅠ位点, 位于药物选择ble基因的上,下游. 结论成功构建弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3.