HIV-1 B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

摘要

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础.方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因.TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag.在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT-PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达.结果重组质粒经BamHⅠ、 XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确.RT-PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达.结论成功构建了HIV-1 B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达.