刚地弓形虫DXR基因的克隆表达与生物学特性分析

摘要

目的 对刚地弓形虫1-脱氧-D-木酮糖-5磷酸还原异构化酶(TgDXR)基因进行克隆、表达、纯化和生物学特性分析.方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取cDNA和基因组DNA;PCR扩增TgDXR的基因片段;构建成熟TgDXR/pET 24b重组原核表达载体;经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达.亲和层析纯化重组TgDXR蛋白,并对该蛋白的生物学特性和酶的动力学活性进行分析.结果 从弓形虫RH株的cDNA和基因组DNA中分别扩增出长度为1 542 bp和5 464 bp的TgDXR片段,成功构建重组质粒;SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠杆菌中高效表达.重组蛋白的相对分子量约50 kDa.酶活性实验显示,Mg2+、Mn2+是最佳金属螯合离子,反应最佳pH值为7.5,该酶活性抑制剂膦胺霉素(Fosmidomycin)对该酶蛋白的IC50为0.52 μmol/L.结论 RH株刚地弓形虫TgDXR可在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有生物学活性,并有望作为弓形虫特异性药物靶标.