多价抗人精浆蛋白/抗人CD3双特异性单链抗体的构建及表达

摘要

目的构建多价抗人精浆蛋白(γ-Sm)/抗人CD3双特异性单链抗体(scFv)基因,并进行真核表达和活性测定.方法利用递归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p53四聚功能域融合基因,克隆入pUC19载体中构建pUC19/IgG3/p53克隆载体.将抗人CD3scFv(CD3scFv)和抗人γ-Sm scFv(γ-Sm scFv)依次克隆入pUC19/IgG3/p53载体中,构建多价双特异性γ-Sm scFv/CD3scFv[scFv2(CD3/γ-Sm)]融合基因.将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2-B中,转染HeLa细胞进行表达,表达产物纯化后流式细胞仪进行活性测定.结果获得了多价scFv2(CD3/γ-Sm)融合基因,基因全长1638 bp,可编码546个氨基酸,与已发表的γ-Sm scFv、CD3scFv和人p53四聚功能域基因cDNA序列一致.表达产物经sDS-PAGE和Western印迹实验证实为约67 000的特异蛋白条带,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC-3细胞和人外周血单个核细胞(PBMC),亲和力高于双特异性scFv.结论获得了可与PBMC和PC-3细胞特异结合的多价scFv2(CD3/γ-sm),为进一步临床应用提供了实验依据.