抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体的构建、表达及生物学活性检测

摘要

BiTEs(bispecificTcellengagers)是以T细胞作为效应细胞的双特异性单链抗体，它采用单链抗体技术，将两个不同抗体的重链及轻链可变区连接在一条多肽链上，并作为活性蛋白在CHO细胞中进行分泌表达，其基本的形式是VL1--linker-VH1-linker-VH2-linker-VL2。BiTEs具有两个抗原结合部位，可以同时和T细胞及病变细胞表面的抗原分子结合，从而有效地激活静止的T细胞来达到杀伤病变细胞的目的。抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体是一种BiTEs形式的极具潜力的新型工程抗体，它以CD20为靶标，具有靶向杀伤B细胞淋巴瘤的功能。 本实验通过重叠延伸PCR扩增获得抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体完整基因片段：前导序列--VLCD3--(G4S)3-VHCD3--(G4S)3-VHCD20--(G4S)3-VLCD20---(His)6---。将上述片段连入瞬时表达载体pcDNA3.1及真核定点表达载体pcDNA5/FRT中，分别获得了瞬时表达及稳定表达质粒。目的基因在FlP-InTMCHO细胞中获得稳定表达，其表达量约为300μg/L培养上清。采用用Ni-NTA纯化系统进行对培养上清进行亲和层析，得到了纯度较高、分子量为59.5KD的目的蛋白。活细胞间接免疫荧光法结果显示此抗体可以与表达CD3抗原的Jurkat细胞以及表达CD20抗原的Ramous细胞发生特异性结合，玫瑰花环实验显示该抗体在体外可诱导效应细胞聚集在靶细胞周围。扫描电镜观察和非放射性细胞杀伤检测实验证明抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体可有效介导IL-2预激活的人外周血淋巴细胞杀伤B淋巴瘤细胞Ramous。在抗体浓度为5μg/ml，反应时间24h时，裂解活性随效靶比的升高而增加，在效靶比为10：1时杀伤活性最高可达87.3％；固定效靶比10：1时，杀伤活性随抗体浓度的升高和反应时间的增加而升高。AV/PI染色表明抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体可能介导T细胞主要以诱导细胞凋亡的方式来起到杀伤靶细胞的作用。采用基因芯片技术检测加药前后Ramous细胞凋亡相关基因的表达变化，推测该抗体介导的T细胞诱导靶细胞主要以ATM-p53途径发生凋亡。以上结果表明抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体具有开发成为一种针对表达CD20抗原的B细胞淋巴瘤的新型治疗性抗体的潜力。

目录

前 言

第一部分抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体表达载体的构建

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体基因在COS-7细胞中的瞬时表达

材料与方法

实验结果

讨论

第三部分抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体基因在Flp-InCHO细胞中的稳定表达、纯化与鉴定

材料与方法

实验结果

讨论

第四部分抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体生物学活性的检测

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

附录——中英文全称对照表

致谢

综述 新型以特异性单链抗体BiTEs及其在肿瘤治疗中的应用前景

发表论文抗CD3/CD20双特异性单链抗体的表达、鉴定及活性分析

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