脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨

摘要

背景:P75神经营养因子受体(P75 neurotrophin receptor,P75NTR)在骨组织中具有促进和抑制骨形成的双向作用,P75NTR过表达可抑制骨髓间充质干细胞的成骨矿化作用。P75NTR可抑制纤维蛋白的降解和骨折周围新生血管的生成导致骨折不愈合,其抑制骨组织修复与其介导凋亡通道有关。目的:研究沉默P75NTR对骨髓间充质干细胞生长活性和碱性磷酸酶活性的影响,以及种植于脱钙骨基质构建组织工程骨复合体的体内异位成骨能力。方法:慢病毒介导沉默P75NTR转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光倒置相差显微镜和Western blot检测荧光蛋白表达和P75NTR蛋白表达;转染两三天后CCK-8实验检测细胞活性,成骨诱导分化培养7 d和14 d,酶标法检测碱性磷酸酶活性;慢病毒介导沉默P75NTR转染骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质培养,光学倒置相差显微镜和扫描电镜下观察脱钙骨基质和骨髓间充质干细胞黏附情况,进一步成骨诱导分化培养7 d,将组织工程骨复合体移植大鼠双侧背部皮下4周,苏木精-伊红染色和碱性磷酸酶染色观察成骨情况。结果与结论:①慢病毒介导沉默P75NTR转染率可达70%左右,P75NTR目的蛋白表达明显低于未转染组和阴性病毒对照组,差异有显著性意义(P<0.05);②与未转染组和阴性病毒对照组比较,沉默P75NTR转染组第5,6天的细胞活性明显增加,差异有显著性意义(P<0.05);与未转染组和阴性病毒对照组比较,沉默P75NTR转染组成骨诱导第7,14天的碱性磷酸酶活性显著增高(P<0.05);③沉默P75NTR转染骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质可以形成良好黏附,该组织工程骨复合体在皮下异位成骨能力显著增强;④结果表明,慢病毒介导沉默P7NTR转染大鼠骨髓基质干细胞种植于脱钙骨基质可制作成良好的骨组织工程骨复合体,该组织工程骨复合体具有一定的异位成骨作用,为骨组织工程治疗骨缺损提供重要的理论基础。