体外分离与培养SD乳鼠神经干细胞实验过程中部分方法的改进

摘要

目的:探讨体外培养与分离SD乳鼠神经干细胞的方法,以便获得大量的神经干细胞。方法:实验于2003-06/10在四川大学华西医学中心细胞生物学教研室完成。分别取出生3d的SD乳鼠侧脑室和大脑皮质,用改进后的胰蛋白酶消化法分离单个细胞,进行细胞培养,加20μg/L表皮生长因子,20μg/L碱性成纤维细胞生长因子刺激生长,用半定量法换培养液,用免疫细胞化学方法对神经干细胞进行鉴定,流式细胞仪分别对每天培养的神经干细胞凋亡率进行检测。结果:①所获得的克隆细胞具有抗巢蛋白免疫荧光反应阳性、具有增殖、血清诱导分化的特性,证明这些细胞为神经干细胞。②培养的侧脑室神经干细胞比大脑皮质的神经干细胞增殖快。③改进的胰蛋白酶消化法得到了1×108L-1单细胞,避免了过度消化或过度机械吹打造成的细胞碎片。④含20μg/L表皮生长因子和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子培养基适合神经干细胞短期培养。⑤流式细胞仪定量检测细胞凋亡率呈下降趋势。结论:SD乳鼠体外培养神经干细胞取材最佳位置应该是脑室管膜或室管膜下。神经干细胞的存活和分裂有赖于表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子按一定比例的共同作用。采用改进的胰酶消化法提高有效细胞产生率,应用半定量换液法可有效减少细胞凋亡率。