外源性绿色荧光蛋白和蛋白酪氨酸激酶受体B基因在大鼠骨髓源性神经干细胞内稳定表达的检测特征

摘要

目的:利用本实验室构建的携带蛋白酪氨酸激酶受体B基因的荧光真核表达质粒-pEGFP-C2-蛋白酩氨酸激酶受体B,转染大鼠骨髓基质细胞源性的神经干细胞,观察其在神经干细胞中的表达情况.方法:实验于2005-06/2006-06在南方医科大学珠江医院神经医学研究所完成.实验选用SD大鼠进行骨髓的采集及骨髓基质细胞的获取,培养1周后得到较纯化的骨髓基质细胞,进行细胞传代培养,传代培养的细胞加入10%胎牛血清及维甲酸以诱导骨髓基质细胞向神经干细胞分化.细胞培养2周后,pEGFP-C2-蛋白酪氨酸激酶受体B经LIPOEECTAMINE.2000脂质体转染培养的大鼠骨髓基质细胞源性的神经干细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白的瞬时表达情况,以酶切和测序鉴定质粒的正确性,凝胶电泳鉴定PCR产物大小,应用免疫组化定量分析法检测转染该质粒的细胞中蛋白酪氨酸激酶受体B的含量,并与正常细胞作比较.结果:①细胞转染24 h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白的表达,表达率约18.1%,随着培养时间的延长,表达绿色荧光蛋白的细胞数量逐渐增多,于1周左右达到高峰,表达率约42.8%,继续观察1个月未发现荧光表达减弱.②酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性,扩增的PCR产物凝胶电泳结果与设计引物间的片段大小1 461 bp完全一致,转染细胞电泳未见目的条带.③免疫组化结果表明,所有细胞均含有蛋白酪氨酸激酶受体B抗原成分,转染pEGFP-C2-蛋白酪氨酸激酶受体B的细胞该抗原成分较未转染细胞明显增加(19.76±3.98,32.17±6.29,P＜0.05).结论:LIPOEECTAMlNE.2000是一种简单而高效的转染大鼠骨髓基质细胞源性神经干细胞的方法,转染的pEGFP-C2-蛋白酪氨酸激酶受体B基因在细胞内可以稳定表达,增强型绿色荧光蛋白可以作为该基因表达的标记.