兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合

摘要

背景;骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异,商接影响组织工程的修复效果.目的:对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合,并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2007-10/12在山西医科人学第二医院骨科实验室完成.材料:清洁级3月龄新两兰白兔2只,由山西畜牧研究所提供.方法:向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液,采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞,每间隔8 h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶,接种5 d后首次换液,细胞融合率达90%时胰酶消化传代,第1、3、5代细胞用于实验.主要观察指标:镜下观察细胞形态及生长状态,绘制细胞生长曲线,测定倍增时间,流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率.结果:原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等,48 h可见贴壁细胞有伸展现象,呈梭形,多角形,成纤维细胞样展开,细胞核清晰,首次换液后可见细胞透亮并充分展开,14 d左右可达90%融合.第1、3,5代骨髓间充质干细胞整体呈S型,1～3d为潜伏期,3 d后进入对数生长期,7～8d为平台期,平均倍增时间为24.22 h.第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,标记率为93.0%.结论:采用密度梯度离心联合差速贴壁、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5 d首次换液的体外分离培养纯化方法,获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好,且纯度较高.