体外三维培养条件下转化生长因子β1基因转染的兔骨髓间充质干细胞促成软骨细胞分化的实验研究

摘要

目的： 1.采用全骨髓漂洗法获取兔骨髓并结合密度梯度离心法从骨髓血中分离出BMSCs加以纯化，进行体外单层培养及三维培养。研究在体外三维培养条件下，兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)传代增殖的生物学特性，建立较为成熟和稳定的BMSCs体外三维培养体系。 2.选择腺病毒载体作为基因转染的载体以提高对外源性DNA的转染率和表达效率。通过对TGF-β1基因重组腺病毒载体Ad.TGF-β1构建的研究，希望建立一套腺病毒载体构建、包装、扩增、纯化及治疗的方法，并对腺病毒载体的性质及生物学活性有初步研究，为今后利用腺病毒载体打下基础。 3.通过研究Ad.TGF-β1基因体外转染BMSCs后BMSCs分别在单层培养和三维培养的不同培养条件下TGF-β1体外表达情况及特异性的软骨细胞外基质分泌情况；探讨基因转染及三维培养体系对诱导BMSCs向软骨细胞定向分化的影响，为临床治疗关节软骨损伤及构建组织工程化软骨提供一个基础性研究和理论依据。 方法： 1.通过采用全骨髓漂洗法获取兔长骨腔骨髓血并结合密度梯度离心法从骨髓血中分离出BMSCs加以纯化，进行体外单层培养及三维培养。研究两种培养条件下BMSCs传代、增殖的生物学特性。 取四周龄新西兰兔，以氯胺酮麻醉后取双侧全长股骨及肱骨，在超净台内无菌条件下用全骨髓漂洗法获得兔长骨腔骨髓血并结合密度梯度离心法从骨髓血中分离出BMSCs并加以纯化、鉴定后进行原代培养，并进一步行单层传代培养及三维培养扩增，研究两种培养条件下BMSCs传代、增殖的生物学特性。 2.TGF-β1基因重组腺病毒粘粒载体(pAdEasy1.TGF-β1)的构建。抽提脾脏组织mRNA，经RT-PCR合成TGF-β1基因，继而再将其插入带有腺病毒基因组的粘粒载体pAdEasy1，扩增后挑选插入方向正确的克隆。 3.TGF-β1基因重组腺病毒载体Ad.TGF-β1的构建。 应用脂质体转染lipofection及DNA-TPC制备重组腺病毒，将酶切鉴定为正确的病毒克隆进一步扩增、纯化和测定滴度。同时对其使用的安全性进行评价。 4.将Ad.TGF-β1基因转染兔骨髓间充质干细胞及促成软骨细胞分化的研究 首先，Ad.TGF-β1基因体外转染BMSCs；将转染后BMSCs分别进行单层培养和三维培养，并用TGF-β1免疫荧光抗体技术、RT-PCR、Western-blot法检测转染后不同条件下TGF-β1体外表达情况。其次，用改进的二甲基亚甲蓝(DMB)比色法测定特异性细胞外基质的糖胺多糖含量、Ⅱ胶原免疫组化、Western-blot法检测转染后在单层培养和三维培养的不同培养条件下特异性软骨细胞外基质Ⅱ胶原分泌情况，研究Ad.TGF-β1转染BMSCs后促成软骨细胞分化的能力。 结果： 1.我们采用全骨髓漂洗法获取兔长骨腔骨髓血并结合密度梯度离心法从骨髓血中分离出BMSCs加以纯化，并成功进行体外单层培养及三维培养。BMSCs在三维培养条件下细胞分裂增殖更活跃，成团族状，传代数更多，维持时间更久。6-8周后才出现细胞老化衰退。细胞计数水平及细胞集落明显高于体外单层传代培养，从而构建了较为稳定的BMSCs体外三维培养体系。这为软骨组织工程获得大规模的种子细胞提供了一种可能。 2.提取的RNA完整、纯度高，RT-PCR合成的DNA片段经克隆、测序后确证为目的基因——TGF-β1基因，插入粘粒载体pAdEasy1后筛选插入方向正确的克隆用于扩增。 3.建立了稳定、有效的TGF-β1基因重组腺病毒载体Ad.TGF-β1构建方法，扩增纯化后重组腺病毒滴度高达1012pfu/ml，体外使用安全。 4.我们用重组腺病毒Ad.TGF-β1能安全、高效的成功转染BMSCs，并通过免疫荧光抗体技术、免疫组织化学染色发现转染后三维培养的BMSCs有大量TGF-β1表达，一直持续到6-8周以后。 5.结果显示转染TGF-β1后BMSCs能持久地分泌显著增加的特异性软骨细胞外基质成分CollagenⅡ、蛋白多糖等。同时发现转染后三维培养组较单层培养组糖胺多糖、CollagenⅡ的分泌量多、维持时间长。这表明转染后BMSCs体外能成软骨细胞分化，并且转染后三维培养组优于单层培养组。 结论： 1.采用全骨髓漂洗法获取兔长骨腔骨髓血并结合密度梯度离心法从中分离出BMSCs加以纯化，并成功进行体外单层培养及三维培养。成功的构建了藻酸钠凝胶三维培养体系，BMSCs在三维培养条件下细胞分裂增殖更活跃，成团族状，传代数更多，维持时间更久。6-8周后才出现细胞老化衰退。更重要的是三维培养体系与体内微环境更相似，为研究骨髓BMSCs在动物体内培养奠定基础。 2.DNA末端蛋白复合物可使重组腺病毒的制备效率大大提高，降低野生型腺病毒出现的概率。重组腺病毒滴度高、纯度好、毒性低。 3.我们构建的携带TGF-β1基因的腺病毒载体，能高效、安全的转染培养的BMSCs。BMSCs能够较持久表达、分泌TGF-β1。转染后三维培养的BMSCs能够较持久表达、分泌TGF-β1，一直持续到6周以后。 4.经转染Ad.TGF-β1后BMSCs能够持续表达高水平的TGF-β1，分泌软骨细胞的特异性细胞外基质成分CollagenⅡ、蛋白多糖等显著增加，同时，BMSCs细胞增殖能力加强。且在转染后三维培养组较单层培养组糖胺多糖、CollagenⅡ的分泌量多、分泌维持时间长。这些表明体外基因转染及三维培养体系具有明显的促进诱导BMSCs更好向软骨细胞分化的作用。

目录

文摘

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主要英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 兔骨髓间充质干细胞分离、培养、三维培养及生物学特性研究

第二部分 转化生长因子β1基因重组腺病毒粘粒载体的构建（pAdEasy1.TGF-β1）

第三部分 TGF-β1基因重组腺病毒载体Ad.TGF-β1的构建

第四部分 Ad.TGF-β1基因转染兔骨髓间充质干细胞及促软骨细胞分化的研究

全文总结

文献综述骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨的研究进展

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