慢病毒介导TGF-β1和IL-10基因转染兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

摘要

目的
　　 软骨损伤性疾病是一类常见的、严重的疾病，发展到一定程度后可致残，加重社会与家庭的负担。关节软骨损伤后自我修复能力很弱，目前软骨缺损的修复仍无理想的方法，以致关节软骨损伤成为了临床上亟待解决的难题。近年来基因工程及组织工程技术的发展为解决这一难题提供了机遇。本课题采用基因转染及组织工程技术，分别构建表达TGF-β1及IL-10目的基因的慢病毒载体，转染体外分离培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)，在细胞因子影响下诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化，通过各项指标的检测，更好的为多基因诱导干细胞定向分化提供理论依据，为构建新型组织工程软骨提供实验依据。
　　 材料和方法
　　 1取2-3月龄健康新西兰大白兔，无菌条件下穿刺针抽取双侧胫骨平台内下侧骨髓6-8ml，梯度密度离心法结合贴壁培养法提取BMSCs，进行原代、传代细胞培养。按加入慢病毒载体的不同分为三组:A组:TGF-β1;B组:TGF-β1+IL-10;C组:空载体组;C组:空白对照组。
　　 2以TGF-β1和IL-10为目的基因，构建TGF-β1-GFP及IL-10-RFP慢病毒表达载体。在重组基因慢病毒载体转染体系中，确定最佳转染效率所需MOI值（感染复数）及作用时间。单基因(TGF-β1)及双基因共转染（TGF-β1和IL-10）在骨髓间充质干细胞中的表达情况。
　　 3取已转染的骨髓间充质干细胞，根据加入慢病毒载体及加入细胞因子IL-1β的不同分为六组:A组:TGF-β1;B组:TGF-β1+IL-1β（IL-1β10ng/ml）;C组:TGF-β1+IL-10;D组:TGF-β1+IL-10+IL-1β;E组:空载体组，加诱导液;F组:空白对照组，常规完全培养基，不加任何诱导液。A-E组滴加软骨细胞诱导液（组成:TGF-β310ng/ml、Vitc50μg/ml、地塞米松10-7M/L、含10％胎牛血清的α-MEM液。）培养。每日倒置相差显微镜观察细胞生长状况，诱导培养7、14天后，收集六组中的细胞，提取mRNA，荧光定量PCR检测SOX-9、Aggrecan、TypeⅡcollagen的表达，同时提取蛋白，WesternBlotting测定TypeⅡcollagen的表达。
　　 结果
　　 1细胞形态学改变倒置相差显微镜下观察，原代培养的BMSCs24h可见少量纺锤或短梭形细胞贴壁”48h后大多数细胞已贴壁、分裂，并出现由单个细胞分裂形成的细胞集落。5-7d后，细胞分裂增殖，形成多个细胞集落。传代细胞贴壁快，5日左右即可长满瓶底形成单层，细胞核大，胞浆内颗粒多，呈平行或漩涡状生长。
　　 2含有单、双目的基因的慢病毒载体转染BMSCs，转染后12h即可有荧光表达，MOI值（感染复数）为100，感染96h后转染效率可达70％左右。
　　 3荧光定量PCR及WesternBlotting检测:培养第7、14天，实验组A-E三个目的基因都有表达，F空白对照组无表达。A组、C组SOX-9、Aggrecan、TypeⅡcollagen的表达水平分别高于加细胞因子IL-1β的B、D组及空载体组，且有统计学差异;D组目的基因表达水平较B组为高，且有统计学意义(P＜0.05);A组和C组间目的基因表达无明显统计学差异。
　　 结论
　　 1BMSCs是软骨组织工程理想的种子细胞，培养法方法简便，易取材及体外扩增，体外培养性能稳定。密度梯度离心法结合全骨髓培养法培养出的BMSCs活力旺盛，易于传代。在一定诱导条件下，BMSCs可以定向分化为软骨细胞。
　　 2利用慢病毒载体转染可使兔骨髓问充质干细胞高效稳定地表达目的基因。
　　 3细胞因子在促进BMSCs细胞增殖和向软骨细胞定向分化方面有重要意义，TGF-β1在BMSCs向软骨细胞分化和增殖时起促进作用。IL-10具有软骨保护作用，可以对抗IL-1β的软骨合成抑制作用。