脂肪干细胞-脱钙骨的玻璃化冻存及复苏

摘要

背景：前期研究应用玻璃化冻存脂肪干细胞-脱钙骨支架复合物1周，得到玻璃化冻存液合适的配比成分。延长玻璃化冻存时间至12周，是否仍能保持细胞活力以及成骨能力值得进一步研究。目的：探讨短时(1周)、长时(12周)玻璃化冻存对组织工程骨中脂肪干细胞增殖活性和成骨能力的影响。方法：分离新西兰大白兔脂肪干细胞，扩增至第3代，接种于猪松质骨来源的脱钙骨，成骨诱导1周。将构建的组织工程骨，转移至含有玻璃化冻存液(30%二甲基亚砜，70%LG-DMEM，0.8 mol/L海藻糖)的2 mL冻存管中，将冻存管投入液氮冻存。分别于冻存后1周和12周，复苏1，3，7，11，13 d，用活死双染试剂染色，共聚焦显微镜观察脂肪干细胞在脱钙骨上的生长情况。复苏1，3，5，7，9，11，13 d，用Hochest33258法检测支架材料上的细胞数目。复苏1，4，7，10，14，21 d，用PNP微板法检测碱性磷酸酶活力，Real-time PCR检测成骨基因Runx2，OCN，COL-1，ALP的表达。结果与结论：①细胞活死双染结果显示，冻存1周或12周后，复苏1 d时红染的死细胞较冻存前红染的死细胞多，复苏3 d后绿染的活细胞逐渐增多；②Hochest33258结果表明，与冻存前的细胞数相比，冻存1周或者12周后，复苏第1，3天的细胞数目有所降低，复苏3 d后细胞数目开始持续增加，复苏第5天细胞数目恢复至冻存前水平；③复苏后1，4 d，碱性磷酸酶活力降低但是与冻存前比较差异无显著性意义，复苏4 d后碱性磷酸酶活力持续升高；④复苏后1，4 d，成骨基因Runx2，Col-1，ALP，OCN表达降低但是与冻存前相比差异无显著性意义，复苏4 d后成骨基因表达持续升高；⑤玻璃化冻存1周与12周比较，复苏后的细胞活力和成骨活性差异均无显著性意义；⑥实验初步证实，玻璃化冻存可以保持组织工程骨的细胞活力与成骨活性；冻存时间(1，12周)对复苏后组织工程骨的成骨能力没有显著影响。