超表达Notch胞内结构域对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

摘要

目的 探讨超表达Notch胞内结构域（Notch intracellular domain,NICD）对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSC）增殖和成骨分化的影响,为牙周病骨缺损的治疗提供依据。方法 以第3代稳定超表达NICD的hPDLSC为实验组,以正常hPDLSC为阴性对照组,转染空载体的hPDLSC为空白对照组,通过细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）检测超表达NICD对hPDLSC增殖能力的影响；通过茜素红染色和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）检测超表达NICD对hPDLSC成骨相关基因：牙骨质附着蛋白（cementum attachment proteins,CAP）、骨钙蛋白、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,RUNX2）,Notch信号通路受体Notch1的影响；通过蛋白质免疫印迹法检测超表达NICD对hPDLSC成骨蛋白RUNX2和flag标记蛋白（用以标记NICD）的影响。结果 CCK-8结果显示,3组1～2 d的A值相比差异均无统计学意义（P＆0.05）；实验组3～7 d的细胞数量（A值分别为0.203±0.016、0.364±0.014、0.449±0.020、0.549±0.020及0.570±0.020）与其他两组相比显著增加（P＆0.05）。茜素红染色结果示,与空白对照组及阴性对照组相比,实验组染色的矿化结节形成范围小颜色浅；qPCR结果显示,实验组14及21 d CAP基因表达量（0.751±0.058、0.887±0.025）、骨钙蛋白基因表达量（0.592±0.051、0.670±0.045）及RUNX2基因表达量（0.319±0.038、0.684±0.055）,均较阴性对照组及空白对照组显著降低（P＆0.05）,但14及21 d的Notch1表达水平（2.507±0.047、4.041±0.219）显著高于阴性对照组及空白对照组（P＆0.05）。蛋白质印迹法结果显示,实验组14及21 d flag标记蛋白表达量（0.167±0.007、0.204±0.010）均显著高于阴性对照组及空白对照组（P＆0.05）,但RUNX2的蛋白表达量（0.075±0.006、0.074±0.013）均显著低于阴性对照组（0.092±0.003、0.118±0.008）及空白对照组（0.174±0.006、0.212±0.008）（P＆0.05）。结论 超表达NICD可以促进hPDLSC的增殖能力,同时抑制其成骨分化。