绵羊Notch1胞内结构域的克隆及其对绵羊肌卫星细胞增殖及分化的作用

摘要

Notch1基因突变能够造成果蝇的残翅，因此而得名。Notch信号通路是调节胚胎期和出生后卫星细胞激活与增殖的一个重要的信号通路，能够影响骨骼肌卫星细胞的特异性及其细胞命运决定，通过调控细胞的增殖、分化和凋亡从而影响肌肉生长。目前，尚未见到绵羊Notch基因的有关报道，尚不清楚Notch基因对绵羊肌卫星细胞的功能和作用，因此，克隆绵羊Notch基因，明确其对绵羊肌卫星细胞的作用，对进一步研究绵羊骨骼肌的发育机制具有重要意义。
　　本研究利用RT-PCR方法克隆了绵羊Notch1胞内段NICD基因，将其与慢病毒表达载体pLEX-mcs连接，构建了pLEX-NICD真核表达载体。利用Preplate法分离了绵羊肌卫星细胞，并采用免疫荧光技术和流式细胞术分析细胞纯度，通过慢病毒感染建立了pLEX-NICD稳定转染的绵羊肌卫星细胞系，采用细胞生长曲线测定、流式细胞术以及免疫荧光技术分析了在过表达情况下NICD对绵羊肌卫星细胞增殖和分化的作用。进一步通过qRT-PCR检测了Notch信号通路相关基因的表达变化，从细胞水平探讨了NICD对绵羊肌卫星细胞增殖及分化的作用机制。本研究获得的主要结果如下:
　　1、克隆了2388 bp绵羊Notch胞内段序列，并提交至Genbank(登录号:KF318190.1)。在绵羊肌卫星细胞中过表达NICD，Western blotting检测显示，NICD在绵羊肌卫星细胞中获得表达。
　　2、利用Preplate差速贴壁法从胎羊肌肉组织中分离培养了肌卫星细胞，利用Pax7、Desmin和MyoD免疫荧光鉴定分离培养的卫星细胞纯度，同时通过流式细胞术确定了纯度达94％。
　　3、细胞生长曲线结果显示，稳定表达NICD基因的肌卫星细胞相较对照细胞生长速度显著减慢（从第二天开始培养至第六天差异极显著(P＜0.01)）。细胞周期测定结果显示稳定表达NICD的肌卫星细胞进入S期的时间比对照细胞晚，且在S期细胞数目比对照细胞数目减少了6.32％。该结果与生长曲线结果相符。表明，NICD对绵羊肌卫星细胞增殖具有抑制作用。
　　4、免疫荧光检测细胞MyHC蛋白表达，计算肌管融合率，结果显示，NICD过表达细胞系肌管融合率为1.4％，显著低于对照组细胞系的6.63％。
　　5、定量结果显示，增殖状态下，Notch上调p21基因的表达，提示Notch通过正调控p21基因的表达抑制绵羊肌卫星细胞增殖;分化状态下，Notch下调MyoD基因的表达，提示Notch通过负调控MyoD基因的表达抑制绵羊肌卫星细胞分化。研究结果表明NICD具有抑制绵羊肌卫星细胞增殖和分化的作用。
　　综上所述，本研究克隆了2388bp的绵羊Notch胞内段基因，成功构建了其慢病毒表达载体pLEX-NICD，经慢病毒感染，获得了稳定表达NICD的绵羊肌卫星细胞系，经细胞生长曲线和流式细胞周期检测，证明NICD基因对绵羊肌卫星细胞增殖及分化具有抑制作用。

目录

声明

论文说明

摘要

常用缩略中英文对照表

第1章 综述

1．1 骨骼肌的结构及发育机理

1．2 骨骼肌卫星细胞

1．3 Notch基因及相关基因的研究进展

第2章 绵羊NICD基因的克隆、真核表达及序列分析

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

第3章 绵羊肌卫星细胞的分离培养及鉴定

3．1 材料与方法

3．2 结果与分析

3．3 讨论

第4章 NICD基因对绵羊肌卫星细胞增殖及分化的作用

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

第5章 总结

参考文献

致谢

个人简历