受体酪氨酸激酶AXL影响新城疫病毒复制及干扰素刺激基因产生的研究

摘要

受体酪氨酸激酶AXL是TAM家族(由TYRO3、AXL和MERTK组成)的成员之一,在机体的许多生理和病理条件下发挥重要作用。为探究AXL对新城疫病毒(NDV)复制及干扰素刺激基因(ISGs)产生的影响,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计了2条AXL的sgRNA和1条阴性对照sgRNA,并分别插入LentiCRISPRv2中构建LentiCRISPRv2-AXL-1、LentiCRISPRv2-AXL-2及阴性对照质粒LentiCRISPRv2-AXL-control,并经菌液PCR和测序鉴定正确后分别与pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞,获得相应重组慢病毒,分别命名为rLenti-AXL1、rLentiAXL2和rLenti-control。同时筛选药物Puromycin对DF-1细胞的最佳使用浓度;将上述慢病毒分别感染DF-1细胞,48 h后利用qPCR检测sgRNA的敲低效果;将敲低效率较高的重组慢病毒感染DF-1细胞,并经最适浓度的Puromycin筛选和亚克隆纯化后获得的细胞分别经qPCR和western blot检测AXL基因及其蛋白水平;将获得的细胞连续传10代后分别取第2、4、6、8、10代细胞经qPCR检测其遗传稳定性。结果显示,2.5μg/mL为Puromycin的最适筛选浓度;qPCR结果显示,rLenti-AXL1和rLenti-AXL2均能敲低DF-1细胞中的AXL基因水平,但后者的敲低效率较高,因此选择rLenti-AXL2进行后续试验;经Puromycin筛选细胞3次后经亚克隆纯化,获得了3株敲低AXL基因的细胞;细胞的qPCR和western blot结果显示,3株细胞中AXL基因及蛋白表达水平均极显著降低;遗传稳定性结果显示,各代细胞中AXL基因的转录水平仍然较低。上述结果表明,获得了敲低AXL基因表达的DF-1细胞系,命名为AXL-KD DF-1细胞。将MOI 1的NDV分别感染DF-1和AXL-KD DF-1细胞后,分别经qPCR和western blot检测Mx1和IFIT5基因的转录水平及细胞中NDV NP蛋白水平。结果显示:无论是否感染NDV,AXL-KD DF-1细胞中Mx1和IFIT5基因的转录水平均显著升高1倍左右(p<0.05);且相比于DF-1细胞,感染NDV的AXL-KD DF-1细胞中NP蛋白的表达量均极显著下降(p<0.0001)。综上结果表明,敲低细胞中的AXL基因后能够抑制NDV复制并且促进Mx1和IFIT5转录水平的显著上调,本研究为了解NDV的致病机制奠定基础。