紫外线抵抗相关基因UVRAG影响狂犬病病毒感染机制的研究

摘要

为研究宿主因子紫外线抵抗相关基因(UVRAG)影响狂犬病病毒(RABV)感染的机制,本研究在HEK293细胞中干扰或过表达UVRAG后感染表达mCherry蛋白的重组RABV(rERA-mCherry),于感染后不同时间(24h、48h、72h、96h)检测上清中病毒的滴度并绘制病毒的生长曲线.结果显示,与转染对照siControl的细胞相比,干扰UVRAG的表达再感染RABV后不同时间细胞上清中的病毒滴度均显著降低(p＜0.01),表明干扰UVRAG的表达后抑制RABV的复制能力;而过表达UVRAG后则不影响RABV的增殖能力.干扰293细胞中UVRAG的表达后分别感染表达RABV G蛋白的重组VSV(rERA-G-VSV)及VSV,6 h后利用qPCR方法检测各细胞中的病毒拷贝数.结果显示,与未干扰的细胞相比,干扰UVRAG表达后细胞中rERA-G-VSV基因拷贝数极显著下降(p＜0.001);但干扰或者未干扰细胞中VSV基因拷贝数则无显著差别.表明RABV G蛋白是rERA-G-VSV在干扰UVRAG表达细胞中增殖下降的原因且UVRAG影响RABV感染的早期侵入阶段.干扰293细胞中UVRAG表达后感染rERA-mCherry,利用酸绕过试验进一步分析RABV感染的阶段;上述干扰细胞感染rERA-mCherry后不同时间点(0、1.5 h、6h)利用qPCR方法检测病毒基因拷贝数,分析UVRAG影响RABV侵入的具体阶段.酸绕过试验结果显示,经pH7.5的PBS处理后,干扰组的细胞相对于未干扰组细胞中RABV基因拷贝数极显著下降(p＜0.001);但pH5.5的酸性PBS处理后两组转染细胞中的病毒拷贝数无显著差异.进一步证明UVRAG在RABV感染早期的侵入阶段发挥重要作用.不同时间点病毒基因拷贝数的qPCR检测结果显示,病毒感染后0、1.5 h两种转染细胞中的病毒拷贝数均无显著差异,但在感染病毒6 h时干扰组的细胞相比于未干扰组的细胞中病毒的拷贝数显著降低(p＜0.01).表明UVRAG影响病毒的胞内运输阶段.利用免疫共沉淀试验(Co-IP)检测UVRAG及其不同结构域蛋白与RABV受体一代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)的相互作用关系,结果显示UVRAG的N端aa1～aa147与mGluR2存在特异性的相互作用.以上结果表明,UVRAG影响RABV的胞内运输可能与其和mGluR2的互作相关.本研究初步揭示了UVRAG在RABV感染中的作用,为RABV侵入机制的揭示奠定了基础.