抵抗猪伪狂犬病毒增殖的重组蛋白及其应用

摘要

本发明公开了一种抵抗猪伪狂犬病毒增殖的重组蛋白，该重组蛋白在合成用于抵抗猪伪狂犬病毒的药品中应用。抵抗猪伪狂犬病毒增殖的重组蛋白，其氨基酸序列为由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在95～100%编码相同功能蛋白质的氨基酸序列，或；SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。本发明将重组蛋白用于抵抗猪伪狂犬病毒的药品中，实验证明：具有显著的抑制效果。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种抵抗猪伪狂犬病毒增殖 的重组蛋白，该重组蛋白在合成用于抵抗猪伪狂犬病毒的药品中应 用。

背景技术

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）最早在1813年美国的牛群中发现， 病牛的临床症状表现为极度瘙痒，所以本病也叫“疯痒病”。1902年， 匈牙利科学家Aujeszky首先分离出了该病毒，故PR又名奥耶斯基氏 病（Aujeszky's disease，AD）。1934年，Sabin和Wright经实验认证 该病毒是疱疹病毒，后来命名为猪疱疹病毒（SHV-1）或伪狂犬病毒 （Pseudorabies virus，PRV）。蛋白质测序分析表明，PRV与马疱疹病 毒（EHV-1）、牛疱疹病毒（BHV-1）、和水痘病毒（VZV）同源性很 高。PRV的宿主包括除高等灵长动物和人以外的其它哺乳动物以及脊 椎动物，猪是PRV感染后可以唯一存活的动物，因此，猪是PRV的 贮存宿主（KretzschmarC.Die Aujeszkysche Krankheit:Diagnostik, Epizootiologie und Bekaempfung.Jena:Fischer,1970）。

PRV遍布世界各国，是典型的极难防疫的自然疫源性疾病，被列 为畜牧业和养猪业的第三大疫病，世界动物卫生组织（OIE）将本病 列为B类疾病，我国也将其列为二类传染病。PRV可以感染多种动 物，以猪和牛最为严重。临床症状的严重程度由感染途径、感染病毒 的毒力、猪只的年龄决定。新生仔猪感染后表现为中枢神经系统症状、 发热、呼吸困难等，出现中枢神经系统的猪一般在症状发生后24～36h 后死亡，仔猪的死亡率很高，可达100%。断奶仔猪（3～6周龄）、幼 龄断奶猪临床症状和新生仔猪相似，但是中枢神经症状不经常出现， 死亡率一般低于50%。生长猪、育肥猪感染PRV后最常见症状是呼 吸症状，无继发症时，死亡率为1%～2%。成年母猪和公猪感染后主 要是呼吸症状。PRV可以通过胎盘屏障，感染胎儿，导致死亡。成年 猪感染PRV的死亡率很少超过2%（Kluge J,Beran G,Hill H and Platt  K.Pseudorabies(Aujeszky's disease).Diseases of swine,1999, 8(233-246.)。

目前该病的预防主要通过疫苗免疫，其中有效的疫苗包括弱毒疫 苗和基因工程基因缺失疫苗。弱毒疫苗是野毒株在异常的条件下培 养，通过反复传代获得，其基因内部有多处点突变或一些基因的缺失， 是一种天然的基因缺失疫苗，具有良好的免疫原性，价格也比较低廉。 最常使用的弱毒疫苗是匈牙利Bartha-K61株和罗马尼亚BUK株。对 这两株弱毒疫苗的核苷酸序列分析发现，Bartha-K61株在其基因组中 存在多处突变，在US区有整个gE基因和US9及部分gI和US2的 缺失，在UL区gC基因、gM基因和ULZI还存在点突变，Bartha-K61 株安全性和免疫原性良好，现在仍然在许多国家使用。对BUK株基 因组分析表明，在US区绝大部分gE基因发生缺失。除了以上两个 弱毒株外，应用比较广泛的毒株还有Norden、GNKJ、MK-25、MK-35、 NIA-4、Ercegovac和Alfort-26株等。弱毒疫苗效果较好，但是一些 实施扑灭计划的国家已不允许使用弱毒疫苗，主要因为以下三个原 因：

①其主要毒力基因TK仍然存在，毒力有可能返强；

②未经充分致弱或过度致弱的疫苗株不仅不能获得满意的免疫 保护反应，反而可能引起疾病再次流行或者免疫抑制；

③弱毒疫苗仍可形成潜伏感染，并有散毒的可能，部分接种猪血 清中存在中和抗体，但仍可排毒数年。

基因工程基因缺失疫苗是指利用分子生物技术对PRV的基因组 进行有目的的改造，构建了单基因、多基因甚至多基因缺失的疫苗。 最初的基因缺失疫苗是通过缺失主要毒力基因TK获得的。TK基因 缺失的疫苗与以前在有致突变剂存在下筛选得到的弱毒疫苗有个明 显的区别，它不会有毒力返强，所以更加安全。Kit等通过缺失BUK 株TK基因中148bp的片段，构建出缺失TK基因的PRV BUK-d13 株，该TK缺失株除了通过生物技术在TK基因处缺失外，还有来自 BUK疫苗在gE基因的缺失，用不同的条件对其在细胞上培养，都可 以达到相同的滴度（Kit S,Kit M,McConnell S and Lawhorn B. Development of active immunity in newborn pigs with colostral  antibodies by vaccination with gIII-deleted PRV.Acta veterinaria  Hungarica,1994,42(2-3):319-330.）。利用生物学方法如Southern印迹 杂交，空斑自显影能把它和其它野毒株相区别。它对小鼠、兔的毒力 也非常低，进一步的实验证明它对猪是安全的，可以产生有效的免疫 保护。该疫苗有个明显的缺点，它不能用血清学方法区别免疫接种猪 和自然感染猪，这给检疫工作带来了极大的困难。之后发展起来的基 因缺失疫苗是在TK缺失疫苗的基础上发展起来的，它比TK缺失疫 苗有更好的优越性。

第二代基因缺失疫苗不但缺失TK基因，而且在编码非必须糖蛋 白的基因内有一个新的缺失，或插入了一个报告基因，这样得到的突 变株就不能产生缺失基因编码的糖蛋白，免疫动物就不能产生相应的 抗体，因此可以通过血清学方法将免疫接种猪与自然感染野毒的猪区 别开来。Moormann等用基因工程方法产生的‘783’株通过基因敲 除的方法缺失了胸腺啥脸核普激酶(TK)的19个碱基和gI基因的2.4 千个碱基而形成的双基因缺失疫苗，其免疫原性与Bartha-61疫苗株 相当，而在小鼠上的安全性要优于Bartha-6l疫苗株，其研制过程要 比Bartha-61疫苗株短得多（Moormann RJM,de Rover T,Briaire J, Peeters BPH,Gielkens ALJ and van Oirschot JT.Inactivation of the  thymidine kinase gene of a gI deletion mutant of pseudorabies virus  generates a safe but still highly immunogenic vaccine strain.Journal of  General Virology,1990,71(7):1591-1595.）。这是基因缺失疫苗优于传 统疫苗的一个很好例证。此类疫苗有TK-/gG-和TK-/gC-等类型，现 在世界上应用比较广泛的‘783’株疫苗就是TK-/gE-型。

上述疫苗对预防该病起到了重要的作用。但是随着伪狂犬毒株的 变异等原因，现有的疫苗有时并不能起到完全的免疫保护作用。同时 由于临床中可能发生的免疫失败造成部分动物感染伪狂犬野毒，对于 这部分动物迫切需要一种针对伪狂犬病毒感染后的治疗药品和制剂。

发明内容

本发明目的在于提供一种抵抗猪伪狂犬病毒增殖的重组蛋白和 编码该蛋白的基因。

本发明的另一个目的在于提供该重组蛋白在合成用于抵抗猪伪 狂犬病毒的药品中应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的具体方案如下：

本发明提供的抵抗猪伪狂犬病毒增殖的重组蛋白，其氨基酸序列 为

1）由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者

2）与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在95～100%编 码相同功能蛋白质的氨基酸序列，或；

3）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或 多个氨基酸且具有同等活性的由1）衍生的蛋白。

编码上述抵抗猪伪狂犬病毒增殖的重组蛋白的基因属于本发明， 本发明还提供了一个编码抵抗猪伪狂犬病毒增殖的重组蛋白的基因 的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

由含编码上述抵抗猪伪狂犬病毒增殖的重组蛋白的基因对的重 组表达载体也属于本发明的范围，该重组表达载体由含有抵抗猪伪狂 犬病毒增殖的重组蛋白的基因原核表达载体组成。该原核载体为 pET-28a表达载体。

本发明提供了一种含有上述重组表达载体的大肠杆菌BL21表达 菌株。

本发明合成用于编码抵抗猪伪狂犬病毒增殖的重组蛋白的基因， 其全长为876bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的 蛋白具有291个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No.2。

该蛋白中蛋白激酶R（protein kinase R,PKR）N端结构域含有2 个dsRNA结合域；C端具有一个激酶结构域。PKR蛋白结合dsRNA 后，自身磷酸化后磷酸化eIF-2alpha，然后阻止病毒蛋白的翻译。细 胞凋亡蛋白激活因子（apoptotic protease activating factor1,Apaf-1）能 够同时结合许多procaspases。这些procaspases通过剪切激活自身， 然后酶解许多细胞蛋白，从而杀伤细胞。当把这两个因子的dsRNA 结合域和procaspases结合域组合成一个融合蛋白，当转染了该蛋白 的细胞遇到dsRNA后就能立即启动细胞凋亡程序。故将其应用于抵 抗猪伪狂犬病毒的药品中有很好的效果。

应该明确的是，本领域技术人员可根据本发明公开的SEQ ID  No.2氨基酸序列，在不影响其蛋白生物活性的前提下，对于其实施 取代、缺少和/或增加一个或多个氨基酸，蛋白质序列比对同源性在 95%以上，所得到所述蛋白的突变体序列。因此本发明还包括对SEQ  ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺少和/或增加一个或多个氨基酸 得到高同源性且具有生物活性和相同功能的衍生蛋白。

本发明的原理

当细胞被病毒感染时，它会劫持这个细胞的营养物质，复制大量 的后代，再去感染其它细胞，复制过程中会产生双股核糖核酸 （dsRNA），通常人的免疫系统会产生一种蛋白质抓住dsRNA，引发 之后一连串反应，终止病毒的复制。同时病毒能通过抑制细胞凋亡的 途径中的早期步骤来对抗感染。如：模拟细胞抗凋亡蛋白Bcl-2，或 者抑制凋亡受体信号。还有些病毒蛋白直接抑制一个或者多个 caspase，如非洲猪瘟病毒A224L（抑制caspase3），poxvirus CrmA（抑 制caspases1,8,and10）。如果设计一种能抓住dsRNA的蛋白质，和 另一种能够引起细胞凋亡的蛋白质相结合，这样当该蛋白的一端抓住 dsRNA时，另一端就会启动细胞凋亡过程，从而杀死感染的细胞。

该蛋白的设计分为第一个部分涉及的是干扰素通路中的dsRNA 检测过程。大多数病毒具有双链或者单链RNA基因组，在其转录和 复制的过程中都会产生长的双链RNA。还有部分DNA病毒，在转录 的过程中同样会产生长的双链RNA。正常细胞不能够产生长的双链 RNA（大于21-23bp），自然的细胞防御利用这种差异产生自身的防 卫机制抵抗病毒的感染。例如：蛋白激酶R（PKR）在N端具有两个 dsRNA的结合域（dsRBM1and2）和一个C端的激酶域。结合长度 至少30-50bp的双链RNA后的PKR通过自身磷酸化后激活。激活的 PKR然后磷酸化eIF-2α，然后阻止病毒或者细胞蛋白的转录。第二个 部分涉及细胞凋亡通路中的凋亡信号分子，如apoptotic protease  activating factor1(APAF-1)或者FLICE activated death domain (FADD)，同时结合多种凋亡前体分子（Procaspases）。前体凋亡分子 通过反式剪切激活，激活其他的凋亡级联反应中的凋亡蛋白酶，然后 切割系列的细胞内蛋白，最后杀伤细胞。

本发明的有益效果在于：

本发明将重组蛋白用于抵抗猪伪狂犬病毒的药品中，实验证明： 具有显著的抑制效果。

附图说明

图1为重组基因的诱导表达

Fig1The induction expression of recombinant gene

Line M:the protein ladder.Line1:the control,

line2:induction expression using IPTG.

图2重组蛋白可溶性表达的分析

Fig3-7The analysis of recombinant protein’s solubility.

Line M:the protein marker.

Line1:the supernatant,

line2:the precipitation.

图33d后细胞的生长状况（A,B,C是未添加重组蛋白的细胞典型 图；D,E,F是添加了重组蛋白的细胞典型图）

Fig3-13The growth condition of the PK15cells3dp

（Fig.A,B,C was the presentation figure of the cells not incubate  with the recombinant protein;

Fig.D,E,F was the presentation figure of the cells incubate with the  recombinant protein）

图4实验组与对照组病毒量的差异

Fig4The antiviral effect of recombinant protein

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明 的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1生物信息学分析设计蛋白分子及其合成的相关基因。

蛋白激酶R（protein kinase R,PKR）N端结构域含有2个dsRNA 结合域；C端具有一个激酶结构域。PKR蛋白结合dsRNA后，自身 磷酸化后磷酸化eIF-2alpha，然后阻止病毒蛋白的翻译。细胞凋亡蛋 白激活因子（apoptotic protease activating factor1,Apaf-1）能够同时结 合许多procaspases。这些procaspases通过剪切激活自身，然后酶解 许多细胞蛋白，从而杀伤细胞。当把这两个因子的dsRNA结合域和 procaspases结合域组合成一个融合蛋白，当转染了该蛋白的细胞遇到 dsRNA后就能立即启动细胞凋亡程序。

在NCBI上检索猪的PKR基因（gi|47523704）和Apaf-1基因 （gi|350584646），分析其结构域，取PKR分子的dsRNA结合域 （1-181aa）和APAF-1分子的procaspases结合域（1-97aa）。便于该 设计分子穿透细胞，前面添加PTD-4肽（YARAAARQARA）标签。

设计的得到氨基酸序列如SEQ ID No.2所示

将该重组蛋白对应的基因序列送往上海生工合成，该基因序列如 SEQ ID No.1所示

实施例2用原核表达载体pET-28a表达并纯化该蛋白

利用以一对引物扩增该基因，引物如下：

sDRACO-1:GACGGGCCGAAGCTTGCTATG

sDRACO-2:GATCCGACGTCTTAGGAAGAAG

将克隆基因连接到pMD18-T载体，通过HindIII和XhoI酶切后连接 到pET-28a表达载体中。测序验证正确后，转化到BL21表达菌株中。 经过IPTG诱导表达，SDS-PAGE证实表达成功（图1）。继续分析重组 蛋白的可溶性：重组菌株用IPTG诱导表达，经超声破碎，离心，收 集上清和沉淀，分析蛋白的可溶性，SDS-PAGE结果显示，在34.5KD 处，上清和沉淀都有条带（图2）。培养重组菌株350ml，用IPTG进 行诱导表达，收菌高压破碎，离心收集上清，用HisTrap^TMHP蛋白层 析住进行纯化。

实施例3细胞实验证实该蛋白（sDRACO）具有显著抑制猪伪狂 犬病毒增殖的能力

步骤如下：

1）把培养48h成良好单层的细胞经胰酶消化成单个细胞，铺到 96孔板，待细胞长到50～80%时进行抗病毒实验；

2）PRV病毒做一系列的10倍稀释；

3）抗病毒实验：实验组同时加入sDRACO和PRV，对照组加入 等量的PBS和PRV；

4）观察细胞病变的时间和孔数并记录；

当病毒加入剂量为10^11.5TCID50时，部分细胞未发生病变，而相 应对照组细胞全部病变（图3）。

分别收集每个孔的病毒，提取病毒DNA，利用伪狂犬病毒定量 PCR引物

PRV-1:CACGGAGGACGAGCTGGGGCT

PRV-2:GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT

进行qPCR实验，实验组相对于对照组PRV拷贝数有2-3个数量 级的下降（图4），以上实验充分证实该重组蛋白具有显著的抑制猪 伪狂犬病毒增殖的能力。