猪TRIM11基因克隆及其对猪伪狂犬病毒增殖影响的研究

摘要

TRIM蛋白是以三基序结构(也叫做RBCC结构域)为特点的蛋白家族，TRIM蛋白参与了各种细胞过程，包括细胞增殖，分化，癌症发生以及凋亡等。许多TRIM蛋白可以作为固有免疫的组分或直接与病毒组分作用调控病毒的感染过程。TRIM11是TRIM蛋白家族的一员，对于人TRIM11的研究发现TRIM11可以抑制HIV-1的侵入，复制与释放，发挥抗病毒作用，又可以负调控IRF3的激活促进HSV-1的感染，可见TRIM11在病毒感染过程中有着复杂的调节作用。目前关于猪TRIM11基因的研究很少，本文构建了稳定表达猪TRIM11的PK15细胞系，为进一步研究猪TRIM11的生物学活性奠定了基础。
　　为了研究猪TRIM11对伪狂犬病毒感染的作用，本研究从猪颌下淋巴结cDNA中扩增出猪TRIM11编码序列，对TRIM11基因进行分析，进行了组织表达谱分析和系统进化分析。利用PiggyBac转座子系统构建真核表达载体PB-TRIM11并将重组载体转染PK15细胞，通过嘌呤霉素筛选及qRT-PCR鉴定获得稳定表达细胞系。用0.1MOI PRV感染过表达TRIM11PK15细胞和转染PB空载体对照组细胞，分别于感染后0h，12h，24h，36h收获细胞上清，检测PRV的滴度(TCID50)。用0.1MOI PRV感染PK15细胞，于感染后0h，12h，24h，36h收获细胞，提取细胞RNA反转录为cDNA检测TRIM11转录水平的变化。用0.1MOI PRV感染过表达TRIM11PK15细胞和转染PB空载体对照组细胞，同时设不感染PRV对照，于感染后12h收获细胞，提取细胞RNA反转录为cDNA检测IFN-β转录水平的变化。用IFN-β-Luc转染过表达TRIM11PK15细胞和转染PB空载体对照组细胞，之后两组细胞接种0.1MOI PRV，同时设不接种病毒对照组，于感染后12h收获细胞，用双荧光素酶报告基因检测IFN-β启动子活性的变化。
　　结果表明，猪TRIM11的ORF长度为1407bp，编码468个氨基酸，蛋白分子量53kDa，等电点为5.409，其蛋白有3个TRIM家族保守的结构域，这三个结构域从N端到C端的顺序依次是RING结构、2个B-box结构域、一个卷曲结构域(Coiled-coil domain)。此外该蛋白C端结构域为最常见的PRY结构域和SPRY结构域。组织表达谱分析的结果显示，猪TRIM11基因在脂肪组织、肺的表达量较高，而在心脏，回肠，十二指肠，直肠中的表达量较低。基因测序结果显示克隆的猪TRIM11cDNA序列正确并成功构建了真核表达载体PB-TRIM11，qRT-PCR检测结果表明TRIM11在PK15细胞系中成功表达。检测感染PRV后过表达TRIM11PK15细胞和对照组细胞上清液病毒的TCID50发现过表达TRIM11组的病毒滴度始终高于对照组，这种差异在12h时更明显(P＜0.05)。提示，过表达TRIM11促进了PRV的增殖，这种作用在PRV感染早期更显著。PRV感染可以抑制PK15细胞中TRIM11的转录水平。TRIM11过表达促进了PRV感染过程中PK15细胞IFN-β的表达。

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中文摘要

1 文献综述

1.1抗病毒固有免疫反应中感受器和信号通路概述

1.2 三基序结合蛋白(TRIM)家族

1.3 猪伪狂犬病毒

1.4 展望

2 引言

3 材料方法

3.1 试验材料

3.2 主要试剂

3.3 主要仪器

3.4 主要溶液及其配制

3.5 猪TRIM11基因的生物信息学分析、克隆与真核表达载体构建

3.6 PB-TRIM11稳定转染PK15细胞系的构建

3.7 TRIM11在PRV增殖中的生物学活性研究

3.8 数据处理

4 结果与分析

4.1 猪TRIM11基因的生物信息学分析

4.2 荧光定量PCR分析猪TRIM11基因的组织特异性

4.3 猪TRIM11基因的克隆

4.4 真核表达载体PB-TRIM11的构建

4.5 猪TRIM11在PK15细胞中的表达

4.6 猪TRIM11生物学作用初步研究

5 结论与讨论

5.1 讨论

5.2 结论

参考文献

英文摘要